Ein neuartiges Sprühgerät hilft Forschern, schnelle Zellprozesse zu erfassen

Zellen sind die Grundbausteine ​​des Lebens. Viele ihrer fundamentalen Prozesse geschehen jedoch so schnell und auf so kleinen Längenskalen, dass aktuelle wissenschaftliche Werkzeuge und Methoden nicht mithalten können. Dies hindert uns daran, ein tieferes Verständnis zu entwickeln.

Nun haben Forscher des SLAC National Accelerator Laboratory, der Stanford University, der Cornell University und anderer Institutionen einen neuen Ansatz entwickelt, um grundlegende biologische Prozesse zu beobachten. Der Ansatz, der kryogene Elektronenmikroskope mit Methoden aus der Röntgenkristallographie kombiniert, könnte unter anderem zu verbesserten Medikamenten und einem tieferen Verständnis der Zellteilung, Photosynthese und Wirt-Pathogen-Interaktionen führen.

Ihre Studie ist veröffentlicht im Journal Molekularbiologie der Zelle.

„Viele zelluläre Prozesse laufen im Millisekundenbereich ab“, sagte Pete Dahlberg, Wissenschaftler am SLAC und Co-Autor der Studie. „Mit unserer neuen Technik können wir eine Zelle anstupsen und dann einen Zeitpunkt auswählen, zu dem wir ein klares Bild ihrer Reaktion aufnehmen möchten.“

Neuinterpretation eines leistungsstarken Sprühwerkzeugs

Seit vielen Jahrzehnten verlassen sich Wissenschaftler auf Bildgebungsverfahren, die als Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) bekannt sind, um in das Innere von Zellen, Proteinen und anderen Organismen und Molekülen zu blicken. Beide Techniken verwenden Elektronenmikroskope, um Schnappschüsse von schockgefrorenen Proben aufzunehmen, die Zellstrukturen in außergewöhnlicher Detailliertheit enthüllt haben.

Bei diesen Ansätzen wird eine Probe auf eine dünne kleine Scheibe, ein sogenanntes Elektronenmikroskopiegitter, gelegt und in eine kryogene Flüssigkeit getaucht, um sie sehr schnell einzufrieren. Dies ist hervorragend geeignet, um Zellproben in ihrem ursprünglichen Zustand zu konservieren, aber die gefrorenen Schnappschüsse verraten den Forschern nicht viel über die Dynamik. Es ist etwa so, als würde man versuchen, Tanzschritte zu lernen, indem man zufällige Bilder von jemandem macht, der tanzt.

Bei ähnlichen Kryo-ET-Experimenten mischen Forscher derzeit Zellproben von Hand, um Bilder von ihnen als Reaktion auf Reize aufzunehmen. Das Mischen von Hand braucht jedoch Zeit, etwa so, als würde man Pfannkuchenteig von Hand und nicht mit einem elektrischen Mixer mischen. Das bedeutet, dass die Experimentatoren Veränderungen in einem Organismus nur in Abständen von etwa zehn Sekunden beobachten können – hundertmal länger, als viele wichtige Prozesse dauern.

„Wenn Sie Zellen in Kryo-ET-Experimenten von Hand mischen und einfrieren, sind Sie oft zu langsam, um die Veränderungen zu erfassen, die Sie wirklich interessieren. Das kann Ihre Fähigkeit einschränken, wichtige biologische Prozesse zu verstehen“, sagte Cali Antolini, Forscherin am SLAC und Co-Autorin der Studie.

Die Forscher griffen daher auf ein Sprühdüsengerät zurück, das häufig in Röntgen-Freie-Elektronen-Lasern (XFEL) und Synchrotronanlagen zum Mischen von Proben für Kristallographie-Experimente verwendet wird. Das Gerät, bekannt als eine mit einem Mischinjektor gekoppelte Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN), wird häufig verwendet, um Molekülbewegungen zu untersuchen, die in extrem kurzen Zeiträumen auftreten, wie Femtosekunden nach Aktivierung mit Licht oder im Millisekunden- bis Sekundenbereich durch chemisches Mischen, bei XFELs wie der Linac Coherent Light Source (LCLS) von SLAC.

„Mit dem Sprühgerät am LCLS können Forscher die Bewegungen von Atomen in Mikrokristallen beobachten“, sagte Dahlberg. „Aber meiner Meinung nach ist das Besprühen von Mikrokristallproben und das Besprühen von Zellproben dasselbe.“

„Wir wollten Lichtquellen- und Kryo-ET-Techniken so weit wie möglich kombinieren“, sagte SLAC- und Stanford-Professor und leitender Co-Autor Soichi Wakatsuki. „Wir wussten, dass dies für die Mikrobiologie und die Entwicklung von Medikamenten von Vorteil sein würde.“

Mit ihrem neuen Ansatz besprühten und froren die Forscher Zellproben, die mit einem Stimulans vermischt worden waren, in Millisekunden ein, statt in 10 Sekunden, wie es das Mischen per Hand dauert. So konnten die Forscher alle 25 Millisekunden Bilder der Zellprobe aufnehmen und Veränderungen in dieser Zeitskala erkennen.

„Unser neuer Ansatz hat dazu beigetragen, einige der interessanten morphologischen Veränderungen in den Zellen zu identifizieren und zu charakterisieren, die wir im Laufe unserer zeitaufgelösten Experimente bemerkt haben“, sagte Jacob Summers, Doktorand an der Stanford University und Co-Autor der Studie.

Vom Strahl zum Nebel

Forscher der Cornell University überarbeiteten die Sprühdüse des LCLS, damit sie für das Kryo-ET-Experiment funktionierte. Doch so einfach, wie das Sprühgerät vom LCLS zu einer Kryo-ET-Maschine zu bringen, war es nicht. Das Problem war, dass die Proben beim LCLS in einem starken Strahl versprüht werden – wie bei einem Gartenschlauch mit aufgedrehter Düse. Diese Kraft und dieser Druck würden für Kryo-ET-Experimente nicht funktionieren, da die Proben auf eine dünne, zerbrechliche Gitteroberfläche gesprüht werden, die unter der Kraft eines Strahls wahrscheinlich zerbrechen würde.

Daher passten die Forscher die Gasdurchflussrate durch die Düse an – ähnlich wie man die Einstellung eines Gartenschlauchs von Strahl auf Sprühnebel ändert. Mit dieser Anpassung erzeugten sie einen feinen Sprühnebel statt eines kräftigen Strahls.

Da es sich um eine relativ neue Technik handelte, waren die richtigen Bedingungen für die Erzeugung eines Sprühnebels praktisch unerforscht, sagte Kara Zielinski, Forscherin an der Cornell University und Co-Autorin des Artikels. Sie mussten viele verschiedene experimentelle Bedingungen testen, wie etwa die Flüssigkeitsdurchflussrate, die Gasdurchflussrate, den Abstand des Sprühers zum Gitter und sogar den Gittertyp, um die optimalen Bedingungen für qualitativ hochwertige Gitter und Datenerfassung zu finden, sagte sie.

Die Forscher variierten außerdem die Durchflussraten der Zell- und Stimulanzienlösungen innerhalb der Sprühvorrichtung und kontrollierten so, wie schnell sich eine Probe vermischte, und starteten so die Uhr für die zellulären Reaktionen, die die Forscher untersuchen wollten.

Nachdem die Forscher diese neue Technik nun erprobt haben, könnte sie auf eine breite Palette von Fragen zur Strukturdynamik auf zellulärer Ebene angewendet werden, sagte Zielinski.

„Es ist immer spannend, am Beginn einer neuen Methode dabei zu sein, denn oft eröffnen sich dadurch völlig neue Wege für biologische Fragen“, sagte sie. „Die Möglichkeiten sind endlos, da wir jetzt durch das Einmischen kleiner Moleküle die Zelldynamik auslösen und direkte strukturelle Beweise für ihre Auswirkungen sammeln können.“

„Ich bin sehr gespannt, was diese Methode in Zukunft bringen könnte“, sagte Joey Yoniles, Co-Autor der Studie und Doktorand an der Stanford University. „Selbst wenn wir nur Bakterien betrachten, wie wir es in dieser Studie getan haben, könnten wir die Wechselwirkung zwischen Bakterien und Medikamenten in extrem hoher Auflösung untersuchen.“