Ein genomweiter Screen in lebenden Wirten enthüllt neue Geheimnisse der Parasiteninfektion

Apicomplexa-Parasiten sind eine häufige Krankheitsursache und infizieren jedes Jahr Hunderte Millionen Menschen. Sie sind verantwortlich für die Verbreitung von Malaria, Kryptosporidiose – einer schweren Durchfallerkrankung bei Kindern – und Toxoplasmose – einer Krankheit, die immungeschwächte Menschen und Föten gefährdet und der Grund dafür ist, dass schwangeren Frauen geraten wird, das Katzenstreu nicht zu wechseln.

Apicomplexa-Parasiten können Menschen und viele andere Tiere sehr gut infizieren und in ihnen überleben. Je mehr Forscher darüber lernen, wie Apicomplexa Wirte infizieren, desto besser können sie wirksame Behandlungen gegen die Parasiten entwickeln.

Zu diesem Zweck haben Forscher im Labor von Sebastian Lourido, Mitglied des Whitehead Institute, unter der Leitung von Doktorand Christopher Giuliano nun ein genomweites Screening des Apicomplexa-Parasiten Toxoplasma gondii (T. gondii), der Toxoplasmose verursacht, während seiner Infektion von Mäusen durchgeführt. Dieses Screening zeigt, wie wichtig jedes Gen für die Fähigkeit des Parasiten ist, einen Wirt zu infizieren, und liefert Hinweise auf die Funktion der Gene.

In ihrer Artikel veröffentlicht in der Zeitschrift Naturmikrobiologie Am 8. Juli geben die Forscher ihren Ansatz zur Rückverfolgung der Abstammungslinien von Parasiten in einem lebenden Wirt bekannt und präsentieren einige besonders interessante Erkenntnisse – darunter ein mögliches Ziel für ein antiparasitäres Medikament.

Vom Gericht zum Tier

Forscher in Louridos Labor hatten bereits 2016 ein Screening entwickelt, um die Funktion aller T. gondii-Gene in Zellen in einer Petrischale zu testen. Sie nutzten die Gen-Editierungstechnologie CRISPR, um mutierte Parasiten zu erzeugen, bei denen in jeder Abstammungslinie ein Gen inaktiviert war.

Die Forscher konnten dann die Bedeutung jedes Gens für die Fitness oder das Überleben eines Parasiten beurteilen, indem sie feststellten, wie gut die Mutanten ohne das jeweilige Gen abschnitten. Starb ein Mutant aus, bedeutete dies, dass sein inaktiviertes Gen für das Überleben des Parasiten unerlässlich ist.

Diese Untersuchung hat den Forschern viel über die Biologie von T. gondii beigebracht, war aber mit einer gemeinsamen Einschränkung verbunden: Die Parasiten wurden in einer Schale und nicht in einem lebenden Wirt untersucht. Zellkulturen bieten eine einfachere Möglichkeit, Parasiten zu untersuchen, aber die Bedingungen sind nicht dieselben, denen Parasiten in einem tierischen Wirt ausgesetzt sind. Der Körper eines Wirts ist eine komplexere und dynamischere Umgebung, sodass Parasiten möglicherweise auf Gene angewiesen sind, die sie in der künstlichen Umgebung einer Zellkultur nicht benötigen.

Um diese Einschränkung zu überwinden, fanden die Forscher in Louridos Labor heraus, wie sie den genomweiten Screen von T. gondii, den ihre Kollegen im Labor zuvor in Zellkulturen durchgeführt hatten, an lebenden Mäusen wiederholen konnten. Dies war ein gewaltiges Unterfangen, das die Lösung verschiedener technischer Herausforderungen und die Durchführung einer großen Anzahl paralleler Experimente erforderte.

T. gondii besitzt etwa 8.000 Gene, daher führten die Forscher gepoolte Experimente durch, bei denen jede Maus von vielen verschiedenen Mutanten infiziert wurde – aber nicht von so vielen, dass die Maus überwältigt wurde. Das bedeutete, dass die Forscher eine Möglichkeit brauchten, die Verläufe der Mutanten in der Maus genauer zu überwachen.

Sie mussten die Abstammungslinien von Parasiten verfolgen, die im Laufe der Zeit die gleiche Mutation trugen, da sie so erkennen konnten, wie sich unterschiedliche Replikationslinien eines bestimmten Mutanten verhielten.

Die Forscher fügten den CRISPR-Werkzeugen Barcodes hinzu, die ein bestimmtes Gen im Parasiten inaktivierten. Wenn sie die Nachkommen des Parasiten ernteten, identifizierte der Barcode die Abstammungslinie und konnte replizierte Parasiten unterscheiden, die auf die gleiche Weise mutiert waren.

Dies ermöglichte den Forschern, einen populationsbasierten analytischen Ansatz zu verwenden, um falsche Ergebnisse auszuschließen und experimentelles Rauschen zu verringern. Dann konnten sie Rückschlüsse darauf ziehen, wie gut jede Linie funktionierte. Durch die Rückverfolgung der Abstammung konnten sie kartieren, wie sich unterschiedliche Parasitenpopulationen durch den Körper des Wirts bewegten und ob einige Populationen in einem Organ besser wuchsen als in einem anderen.

Die Forscher fanden 237 Gene, die in einem lebenden Wirt mehr zur Fitness des Parasiten beitragen als in einer Zellkultur. Von vielen dieser Gene war bisher nicht bekannt, dass sie für die Fitness des Parasiten wichtig sind. Die im aktuellen Screening identifizierten Gene sind in verschiedenen Teilen des Parasiten aktiv und beeinflussen verschiedene Aspekte seiner Interaktion mit einem Wirt.

Die Forscher fanden auch Fälle, in denen die Fitness des Parasiten in einem lebenden Wirt zunahm, wenn ein Gen inaktiviert wurde. Diese Gene könnten beispielsweise mit Signalen zusammenhängen, die das Immunsystem des Wirts verwendet, um die Parasiten zu erkennen. Als nächstes verfolgten die Forscher einige der fitnessverbessernden Gene, die besonders interessant waren.

Gene, die bei einem lebenden Wirt den Unterschied machen

Ein Gen, das besonders auffiel, war GTP-Cyclohydrolase I (GCH), das für ein Enzym kodiert, das an der Produktion des lebenswichtigen Nährstoffs Folat beteiligt ist. Apicomplexa-Falter sind auf Folat angewiesen, und deshalb wollten die Forscher verstehen, welche Rolle GCH dabei spielt, Folat für den Parasiten zu sichern.

Zellkulturmedien enthalten viel Folsäure und in dieser nährstoffreichen Umgebung ist GCH nicht unbedingt erforderlich. Bei einer lebenden Maus muss der Parasit jedoch Folsäure sowohl abbauen als auch mithilfe des GCH enthaltenden Stoffwechselwegs synthetisieren. Lourido und Giuliano haben neue Details zur Funktionsweise dieses Stoffwechselwegs aufgedeckt.

Obwohl die Rolle von GCH bisher nicht vollständig verstanden wurde, ist die Bedeutung von Folat für Apicomplexa eine bekannte Schwachstelle, die bei der Entwicklung antiparasitärer Therapien genutzt wurde. Das Antifolat-Medikament Pyrimethamin wurde häufig zur Behandlung von Malaria eingesetzt, aber viele Parasiten haben eine Resistenz dagegen entwickelt.

Bei einigen medikamentenresistenten Apicomplexa ist die Anzahl ihrer GCH-Genkopien gestiegen, was darauf schließen lässt, dass sie die GCH-vermittelte Folatsynthese nutzen, um Pyrimethamin zu überwinden. Die Forscher fanden heraus, dass die Kombination eines GCH-Inhibitors mit Pyrimethamin die Wirksamkeit des Medikaments gegen die Parasiten erhöhte.

Der GCH-Hemmer war auch allein wirksam. Leider greift der derzeit verfügbare GCH-Hemmer sowohl die Folatwege von Säugetieren als auch von Parasiten an und ist daher für die Anwendung bei Tieren nicht sicher. Giuliano und seine Kollegen arbeiten an der Entwicklung eines parasitenspezifischen GCH-Hemmers als mögliche Therapie.

„Es gab eine ganze Hälfte des Folatstoffwechselwegs, von der man bisher dachte, sie sei für Parasiten nicht wichtig, einfach weil die Menschen so viel Folat zum Zellkulturmedium hinzufügen“, sagt Giuliano. „Dies ist ein gutes Beispiel dafür, was bei Zellkulturexperimenten übersehen werden kann, und besonders spannend ist, dass uns diese Entdeckung zu einem neuen Medikamentenkandidaten geführt hat.“

Ein weiteres interessantes Gen war RASP1. Die Forscher stellten fest, dass RASP1 nicht an ersten Infektionsversuchen beteiligt ist, aber benötigt wird, wenn die Parasiten scheitern und einen zweiten Versuch starten müssen.

Sie fanden heraus, dass RASP1 benötigt wird, um ein Organell der Parasiten, eine sogenannte Rhoptrie, neu zu laden, mit dem die Parasiten Wirtszellen durchbrechen und neu programmieren. Ohne RASP1 könnten die Parasiten nur einen Satz Rhoptrien einsetzen und so nur einen Invasionsversuch unternehmen.

Die Identifizierung der Funktion von RASP1 bei Infektionen zeigte auch, wie wichtig es ist, die Interaktion von Parasiten mit verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. In der Zellkultur züchten Forscher Parasiten normalerweise in Fibroblasten, einer Bindegewebszelle.

Die Forscher fanden heraus, dass Parasiten Fibroblasten mit oder ohne RASP1 befallen können, was darauf schließen lässt, dass dieser Zelltyp für sie leicht zu befallen ist. Wenn die Parasiten jedoch versuchten, in Makrophagen, eine Immunzelle, einzudringen, scheiterten die Parasiten ohne RASP1 oft, was darauf hindeutet, dass Makrophagen für die Parasiten eine größere Herausforderung darstellen und mehrere Versuche erfordern.

Die Untersuchung deckte andere wahrscheinlich zelltypspezifische Wege auf, die bei alleiniger Verwendung von Modellzelltypen in einer Petrischale nicht gefunden worden wären.

Der Bildschirm zeigte auch ein bisher unbenanntes Gen, das die Forscher GRA72 nennen. Frühere Studien legten nahe, dass dieses Gen eine Rolle bei der Vakuole oder Schutzhülle spielt, die der Parasit um sich herum bildet. Die Forscher im Lourido-Labor bestätigten dies und entdeckten zusätzliche Details darüber, wie das Fehlen von GRA72 die Vakuole des Parasiten stört.

Eine reiche Ressource für die Zukunft

Lourido, Giuliano und ihre Kollegen hoffen, dass ihre Erkenntnisse neue Einblicke in die Biologie der Parasiten geben und, insbesondere im Fall von GCH, zu neuen Therapien führen. Sie beabsichtigen, weiterhin aus der Fundgrube an Ergebnissen zu schöpfen – ihre Untersuchung hat viele weitere interessante Gene identifiziert, die einer weiteren Untersuchung bedürfen –, um mehr über Apicomplexa-Parasiten und ihre Wechselwirkungen mit Säugetierwirten zu erfahren.

Lourido sagt, dass andere Forscher in seinem Labor die Ergebnisse des Screenings bereits genutzt haben, um in ihren eigenen Projekten auf relevante Gene und Signalwege aufmerksam zu werden.

„Dies ist eine herausragende Ressource“, sagt Lourido, der auch außerordentlicher Professor für Biologie am MIT ist. „Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen ein viel breiteres Spektrum der Art und Weise, wie die Parasiten mit ihren Wirten interagieren, und bereichern unsere Wahrnehmung der Fähigkeiten und Verwundbarkeiten der Parasiten.“