Ein DNA-Montagekit zur Erschließung des CRISPR-Cas9-Potenzials für das Metabolic Engineering

Die geclusterten, regelmäßig beabstandeten kurzen Palindromwiederholungen (CRISPR) und das Crispr-assoziierte Protein 9 (CRISPR/Cas9) ist heute eine bekannte, revolutionäre Methode zur Herstellung mikrobieller Zellen.

Ein wesentlicher Vorteil von CRISPR bleibt das Stammdesign, das die chromosomale Integration erleichtert und so den Aufbau markerfreier DNA ermöglicht. Diese Bearbeitungssysteme sind äußerst nützlich; Ihre Montage ist jedoch nicht ganz einfach und kann ihre Verwendung und Anwendung verhindern.

In einem neuen Bericht in NaturkommunikationsbiologieTigran V. Yuzbashev und ein Forschungsteam identifizierten die Grenzen der vorhandenen Cas9-Toolkits, die den Zugang und die Implementierung von CRISPR-Techniken erleichtern sollen. Sie diskutierten drei verschiedene, gut etablierte Methoden und kombinierten sie zu einem umfassenden Toolkit für effizientes Metabolic Engineering unter Verwendung von CRISPR/Cas9.

Ein einziges Toolkit bestehend aus 147 Plasmiden zur Generierung und Charakterisierung einer Bibliothek von 137 Promotoren zum Aufbau eines Homogentisinsäure im Labor.

Genomveränderungen mit CRISPR/Cas9

Das CRISPR/Cas9-System kann schnelle, präzise und narbenfreie Genommodifikationen durchführen und bietet so einen erheblichen Spielraum für die Entwicklung mikrobieller Stämme für die Bioproduktion. Beispielsweise stellt die Stoffwechseltechnik von Hefen einen schnell wachsenden Bereich in der Ingenieurbiologie für die nachhaltige Produktion von Chemikalien, Kraftstoffen, Lebensmittel und Arzneimittel.

Hefen haben ein Stoffwechselpotenzial wie eukaryotische Zellen und sind daher einfacher in großem Maßstab zu entwickeln und zu kultivieren. Infolgedessen haben Bioingenieure entworfen und entwickelt CRISPR-Systeme für Hefen.

Aufgrund seiner hohen Effizienz ermöglicht CRISPR markerlose genomische Veränderungen. In dieser Arbeit sorgte Yuzbashev für die Stammoptimierung und erleichterte Metabolic-Engineering-Projekte, indem er drei Verbesserungen des CRISPR/Cas9-Systems für das Hefe-Engineering identifizierte. Zu den Methoden gehörten: 1) der einfache Wechsel zwischen marker- und markerlosen Modifikationen, 2) der schnelle Austausch von Homologiearmen zur Bestimmung verschiedener Integrationsorte und 3) eine einfache Methode zum Klonen gRNAs.

Markerfreie Integration

Um eine markerfreie CRISPR-basierte Integration zu ermöglichen, wählte das Team einen durch Cas9 induzierten Doppelstrangbruch, der repariert werden musste, um die Zellproliferation zu ermöglichen. Möglich machten die Wissenschaftler dies durch die Verwendung einer Vorlage oder eines Spenders, integriert durch homologe Rekombination oder nichthomologe Endverbindung (NHEJ) – ohne Integration. Der Prozess der nicht homologen Endverbindung wird bei den meisten Pilzarten, einschließlich Bäckerhefe, beobachtet Saccharomyces cerevisiae.

Bei Arten mit einem vorherrschenden NHEJ-Mechanismus verbesserte das Team die homologe Rekombination durch die Löschung der NHEJ-Gene. Sollte eine markerfreie Methode keinen Erfolg haben, wollen die Wissenschaftler anschließend die CRISPR-Cas9-unterstützte Integration verbessern, um problemlos zur markerbasierten Integration zurückzukehren.

Neuausrichtung der Spender-DNA

Die Cas9-unterstützte Integration erfordert typischerweise eine Spendervorlage, die aus einer integrierten Kassette besteht, die von zwei Homologiearmen flankiert wird. Das Team stellte die Theorie auf, dass die ideale Integration von CRISPR/Cas9 darin bestehen sollte, Homologiearme auf vorab bewerteten Cas9-Spenderkonstrukten über eine vereinfachte Methode auszutauschen Reaktion der Golden-Gate-Versammlung.

Darüber hinaus sind Promotoren ein Schlüsselelement jedes Metabolic-Engineering-Projekts, um den Fluss in Richtung des Stoffwechsels umzulenken Produkte von Interesse. Yuzbashev et al. verwendete Industriehefe Yarrowia lipolytica ein Metabolic-Engineering-Toolkit zu entwickeln, das Genbearbeitungs- und DNA-Assemblierungsstrategien für hohe Effizienz und Vielseitigkeit kombiniert.

Modulare Architektur des Toolkits und Stoffwechselweg-Engineering

Die Wissenschaftler erschlossen das volle Potenzial von CRISPR/Cas9 für das Metabolic Engineering, indem sie ein Toolkit entwickelten, das dies weiter ausbaute bisher bekannt Golden Gate-Montagesysteme. Sie testeten das Screening-System, indem sie mehrere Promotorbibliotheken erstellten. Yuzbashev et al. wählten Y. lipolytica-ribosomale Gene, die für Proteine ​​großer und kleiner Untereinheiten kodieren. Sie identifizierten eine Vielzahl von Promotoren mit unterschiedlichen Stärken, um die Anzahl der Promotoren für denselben Organismus zu erhöhen.

Um den Einfluss und die Verwendung der verbesserten CRISPR/Cas9-Methode zu beweisen, erstellte das Team mithilfe rationaler Technik eine Y. lipolytica, um eine zu produzieren Homogentisinsäure (HGA) . Typischerweise wird HGA unter alkalischen Bedingungen spontan oxidiert und bildet eine Selbstpolymerisation Pyomelanin; ein ausgezeichneter Bestandteil von natürliche Sonnenschutzmittel und Kosmetika.

Trotz seines hohen kommerziellen Potenzials beruhten bestehende Methoden zur Herstellung des Säurevorläufers und des Pyomelaninprodukts auf der Biotransformation von teure aromatische Aminosäuren. Um das Metabolic Engineering zu erleichtern, wählte das Team daher zunächst mehrere Gene aus, die das kodierenVorläufer aromatischer Aminotransferasen als technische Ziele. Anschließend wählten sie drei Überexpressionsziele aus, um die De-novo-Synthese der Homogentisinsäure im Modellorganismus zu verbessern. Schließlich untersuchten und inaktivierten sie den HGA-Abbauweg; ein bei Y. lipolytica bisher unbekannter Weg.

Ausblick

Auf diese Weise zeigten Tigran V. Yuzbashev und Kollegen die Abhängigkeit des Metabolic Engineering lebender Organismen von effizienten DNA-Manipulationsmethoden. Diese Arbeit präsentiert ein Beispiel für ein verbessertes molekulares Toolkit, das für das CRISPR/Cas9-basierte Metabolic Engineering entwickelt wurde.

Die Wissenschaftler bewiesen die Funktionalität der Plattform sowohl für den schnellen Stammaufbau als auch für die Charakterisierung einer großen Bibliothek von Promotoren. Sie gehen davon aus, dass dieses Toolkit breitere Anwendungen in der Dehnungstechnik und in der Industrie finden wird. Das Team ging davon aus, dass das in dieser Arbeit entwickelte Y. lipolytica-Modell auch in anderen Bereichen der Biotechnik übergreifende Anwendungen haben könnte.

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