Durch die Kombination einzigartiger Methoden entdecken Forscher neue Proteinfunktionen und erforschen den physikalischen Raum von Proteinen

Forscher im Labor von John Kuriyan, Professor für Biochemie und Dekan der School of Medicine Basic Sciences, haben ein Schlüsselelement der Funktionsweise einer molekularen Maschine enthüllt, die für die Hochgeschwindigkeits-DNA-Replikation verantwortlich ist. Die Ergebnisse ihrer Studie bauen auf wachsenden Theorien der molekularen Evolution auf.

Der Artikel, „Autoinhibition einer Clamp-Loader-ATPase, nachgewiesen durch Tiefenmutagenese und Kryo-EM,“ wurde in der Zeitschrift veröffentlicht Struktur- und Molekularbiologie der Natur.

Clamp-Loader – Proteine, die dabei helfen, die DNA-Replikationsmaschinerie auf die DNA zu laden – haben eine Vielzahl biologischer Funktionen, die sich mit der Entwicklung ihrer Struktur ändern. Diese Proteine ​​kommen im gesamten Leben vor – vom einzelligen Organismus bis zum Menschen. Im Laufe des letzten Jahrzehnts glaubte man anhand einiger Schnappschüsse seiner dreidimensionalen Struktur, den Aufbau und die Funktion des Klemmladers gut verstanden zu haben. Diese von den Co-Erstautoren, Postdoktorandin Kendra Marcus und wissenschaftlichem Assistenzprofessor Yongjian Huang geleitete Forschung enthüllte das Gesamtbild.

„Durch die Kombination von Tiefenmutagenese und kryogener Elektronenmikroskopie haben wir ein wichtiges strukturelles Zwischenprodukt gefunden, das in diesen nicht zu sehen war.“ [snapshots] und veranschaulichte die Konformationsänderungen, die der Klemmlader benötigt, um seine Aufgabe zu erfüllen“, sagte Marcus. „Darüber hinaus sehen wir, dass Regionen des Proteins, die wir für ‚unwichtig‘ hielten, an hochkoordinierten Prozessen beteiligt sind.“

Die einzigartige Kombination von Tiefenmutagenese und Kryo-EM führte zu dieser Entdeckung. Die Tiefenmutagenese kartiert wichtige Regionen eines Proteins, indem sie seine Mutationsempfindlichkeit oder die Art und Weise, wie ein Protein auf eine Mutation reagiert, aufdeckt, und Kryo-EM erzeugt dreidimensionale Visualisierungen, die normalerweise nicht in Kristallstrukturen zu sehen sind. Die Untersuchung der Mutationsempfindlichkeit von Proteinen gibt Aufschluss darüber, wie die Proteinarchitektur ihre Funktion beeinflusst und wie die Evolution diese Variablen anpassen kann, um Proteinen neue Aufgaben zu geben.

Die Forscher leiteten zunächst anhand der Tiefenmutagenesedaten einen neuen Zustand des Klemmladers ab und visualisierten ihn dann mithilfe von Kryo-EM, was einen bisher ungesehenen Konformationszustand oder eine Anordnung von Atomen enthüllte, die dem Klemmlader seine Form verleiht.

„Eine der einzigartigen Stärken der Kryo-EM liegt in ihrer Fähigkeit, das Ensemble der Konformationszustände zu erfassen, die von diesen makromolekularen Maschinen wie dem Klemmlader angenommen werden“, sagte Huang. „In dieser Studie ermöglicht uns Kryo-EM die Visualisierung der molekularen Details eines neu entdeckten Konformationszustands und der kritischen Konformationsänderungen, die für die Funktion des Klemmladers erforderlich sind.“

Diese Erkenntnisse haben Auswirkungen auf die Evolutionstheorie und darauf, wie Proteine ​​„unbedeutende“ Plätze in diesen molekularen Maschinen nutzen, um bei der Anpassung neuer Funktionen bedingt wichtig zu werden, sagte Marcus.

Im Anschluss an diese Entdeckung wird das Kuriyan-Labor Techniken des maschinellen Lernens nutzen, um auf der Grundlage ihrer aktuellen Erkenntnisse neue Clamp-Loader-Proteine ​​zu entwerfen und zu testen. Diese Art von Experimenten bietet einen enormen Nutzen für das Verständnis, wie Proteine ​​aufgrund krankheitsbedingter Mutationen oder als Reaktion auf Medikamente ihre Funktion verändern.

„Wir hoffen, dass diese Ergebnisse Biochemiker und Molekularbiophysiker dazu inspirieren, kreative Methoden zur Erforschung des physikalischen Raums von Proteinen anzuwenden“, sagte Marcus. „Diese Arbeit zeigt, wie die Evolutionstheorie unser strukturell orientiertes Verständnis von Proteinfunktionen verbessern kann.“