Drosophila Embryonalentwicklung bei Einzelzellauflösung

Wissenschaftler haben die bisher vollständigste und detaillierteste Einzelzellkarte der Embryonalentwicklung eines Tieres erstellt, wobei sie die Fruchtfliege als Modellorganismus verwendeten.

Veröffentlicht in Wissenschaft, nutzt diese Studie unter der gemeinsamen Leitung von Eileen Furlong vom EMBL und Jay Shendure von der University of Washington Daten von mehr als einer Million embryonaler Zellen, die alle Stadien der Embryonalentwicklung abdecken, und stellt einen bedeutenden Fortschritt auf mehreren Ebenen dar. Diese Grundlagenforschung hilft Wissenschaftlern auch dabei, Fragen nachzugehen, wie Mutationen zu unterschiedlichen Entwicklungsstörungen führen. Darüber hinaus bietet es einen Weg zum Verständnis des riesigen nicht-kodierenden Teils unseres Genoms, der die meisten krankheitsassoziierten Mutationen enthält.

„Allein die gesamte Embryogenese – alle Stadien und alle Zelltypen – zu erfassen, um einen vollständigeren Überblick über die Zellzustände und molekularen Veränderungen zu erhalten, die die Entwicklung begleiten, ist eine Meisterleistung für sich“, sagte Eileen Furlong, Leiterin der Abteilung Genombiologie des EMBL . „Aber was mich wirklich begeistert, ist die Verwendung von Deep Learning, um einen kontinuierlichen Überblick über die molekularen Veränderungen zu erhalten, die die embryonale Entwicklung vorantreiben – bis auf die Minute.“

Die Embryonalentwicklung beginnt mit der Befruchtung einer Eizelle, gefolgt von einer Reihe von Zellteilungen und Entscheidungen, die zu einem sehr komplexen, vielzelligen Embryo führen, der sich bewegen, essen, wahrnehmen und mit seiner Umgebung interagieren kann. Forscher untersuchen diesen Prozess der Embryonalentwicklung seit über hundert Jahren, aber erst im letzten Jahrzehnt haben neue Technologien Wissenschaftler in die Lage versetzt, molekulare Veränderungen zu identifizieren, die Zellübergänge auf Einzelzellebene begleiten.

Diese Einzelzellstudien haben eine enorme Aufregung ausgelöst, da sie die Komplexität von Zelltypen in Geweben demonstrierten, sogar neue Zelltypen identifizierten und ihre Entwicklungsbahnen zusätzlich zu den zugrunde liegenden molekularen Veränderungen enthüllten. Versuche, die gesamte Embryonalentwicklung mit Einzelzellauflösung zu profilieren, waren jedoch aufgrund vieler technischer Herausforderungen bei der Probenahme, den Kosten und den Technologien unerreichbar.

In dieser Hinsicht hat die Fruchtfliege (Drosophila melanogaster), ein herausragender Modellorganismus in der Entwicklungsbiologie, Genregulation und Chromatinbiologie, einige entscheidende Vorteile, wenn es darum geht, neue Ansätze zu entwickeln, um dies anzugehen. Die Embryonalentwicklung der Fruchtfliege erfolgt extrem schnell; Innerhalb von nur 20 Stunden nach der Befruchtung haben sich alle Gewebe gebildet, einschließlich Gehirn, Darm und Herz, sodass der Organismus kriechen und essen kann. Dies, in Kombination mit den vielen Entdeckungen bei Fruchtfliegen, die das Verständnis der Funktionsweise von Genen und ihren Produkten vorangetrieben haben, ermutigte das Furlong-Labor und seine Mitarbeiter, sich dieser Herausforderung zu stellen.

„Unser Ziel war es, einen kontinuierlichen Überblick über alle Stadien der Embryogenese zu erhalten, um alle Dynamiken und Veränderungen während der Entwicklung eines Embryos zu erfassen, nicht nur auf der Ebene der RNA, sondern auch der Kontrollelemente, die diesen Prozess regulieren“, sagte Co-Autor Stefano Secchia, ein Ph.D. Student in der Furlong-Gruppe.

Vorarbeiten mit „Enhancern“

Im Jahr 2018 zeigten die Furlong- und Shendure-Gruppen die Machbarkeit von Profilierung von „offenem“ Chromatin bei Einzelzellauflösung in Embryonen und wie diese DNA-Regionen oft aktive Entwicklungsverstärker darstellen. „Enhancer“ sind DNA-Segmente, die als Kontrollschalter fungieren, um Gene ein- und auszuschalten. Die Daten zeigten, welche Zelltypen im Embryo zu einem bestimmten Zeitpunkt welche Enhancer verwenden und wie sich diese Verwendung im Laufe der Zeit ändert. Eine solche Karte ist für die verstehen, was bestimmte Aspekte der Embryonalentwicklung antreibt.

„Ich war wirklich aufgeregt, als ich diese Ergebnisse sah“, sagte Furlong. „Über die RNA hinauszugehen und diese regulatorischen Schalter in einzelnen Zellen stromaufwärts zu betrachten, war etwas, das ich lange Zeit nicht für möglich gehalten hätte.“

Über „Schnappschüsse“ hinausgehen

Die Studie aus dem Jahr 2018 war damals auf dem neuesten Stand der Technik und profilierte ~20.000 Zellen in drei verschiedenen Fenstern der Embryonalentwicklung (am Anfang, in der Mitte und am Ende). Diese Arbeit lieferte jedoch immer noch nur Momentaufnahmen der zellulären Diversität und Regulation zu bestimmten diskreten Zeitpunkten. Das Team untersuchte daher das Potenzial der Verwendung von Proben aus sich überschneidenden Zeitfenstern und wandte das Konzept als Beweis des Prinzips auf eine bestimmte Abstammungslinie an –der Muskel.

Dies bereitete dann die Bühne für eine dramatische Skalierung neue Technologie, die im Shendure-Labor entwickelt wurde. Die aktuelle Arbeit des Teams profilierte offenes Chromatin aus fast einer Million Zellen und RNA aus einer halben Million Zellen aus sich überschneidenden Zeitpunkten, die die gesamte Entwicklung des Fruchtfliegenembryos umfassen.

Mithilfe einer Art maschinellen Lernens nutzten die Forscher die sich überschneidenden Zeitpunkte, um die Zeit mit einer viel feineren Auflösung vorherzusagen. Co-Autor Diego Calderon, ein Postdoktorand im Shendure-Labor, trainierte ein neuronales Netzwerk, um die genaue Entwicklungszeit für jede Zelle vorherzusagen.

„Obwohl die gesammelten Proben innerhalb eines Zeitfensters von 2 oder 4 Stunden Embryonen mit leicht unterschiedlichem Alter enthielten, ermöglicht Ihnen diese Methode, in einen beliebigen Teil dieser Embryogenese-Zeitleiste im Minutenbereich hineinzuzoomen“, sagte Calderon.

Shendure fügte hinzu: „Ich war erstaunt, wie gut das funktioniert. Wir konnten molekulare Veränderungen erfassen, die sehr schnell in der Zeit, in Minuten, auftreten, die frühere Forscher entdeckt hatten, indem alle drei Minuten Embryonen von Hand gepflückt wurden.“

In Zukunft wäre ein solcher Ansatz nicht nur zeitsparend, sondern kann auch als Referenz für die normale Embryoentwicklung dienen, um zu sehen, wie sich die Dinge in verschiedenen mutierten Embryonen verändern könnten. So könnte genau festgestellt werden, wann und in welchem ​​Zelltyp der Phänotyp einer Mutante entsteht, wie die Forscher im Muskel zeigten. Mit anderen Worten, diese Arbeit hilft nicht nur zu verstehen, wie Entwicklung normalerweise abläuft, sondern öffnet auch die Tür zum Verständnis, wie verschiedene Mutationen sie durcheinander bringen können.

Das neue Vorhersagepotenzial, das diese Forschung auf der Grundlage von Proben aus viel größeren Zeitfenstern bietet, könnte als Rahmen für andere Modellsysteme verwendet werden. Zum Beispiel die Entwicklung von Säugetierembryos, in-vitro Zelldifferenzierung oder sogar nach medikamentöser Behandlung in erkrankten Zellen, wo Lücken in den Probenahmezeiten entworfen werden können, um eine optimale Zeitvorhersage mit einer Finder-Auflösung zu erleichtern.

Für die Zukunft plant das Team, die Vorhersagekraft des Atlas zu untersuchen.

„Durch die Kombination all der uns zur Verfügung stehenden neuen Werkzeuge in Einzelzellgenomik, Berechnung und Gentechnik würde ich gerne sehen, ob wir vorhersagen können, was mit dem Schicksal einzelner Zellen passiert in vivo nach einer genetischen Mutation“, sagte Furlong. „…aber so weit sind wir noch nicht. Allerdings dachte ich vor diesem Projekt auch, dass die jetzige Arbeit so schnell nicht möglich sein würde.“