Discovery bietet Ausgangspunkt für bessere Gen-Editing-Tools

CRISPR hat das Zeitalter der Genommedizin eingeläutet. Aus dem beliebten CRISPR-Cas9 wurde eine Reihe leistungsstarker Werkzeuge entwickelt, um genetische Krankheiten zu heilen. Es gibt jedoch ein Problem auf der letzten Meile – diese Werkzeuge müssen effektiv in jede Zelle des Patienten gebracht werden, und die meisten Cas9s sind zu groß, um in beliebte Genomtherapievektoren wie das Adenovirus-assoziierte Virus (AAV) eingebaut zu werden.

Cornell-Wissenschaftler liefern in neuen Forschungsergebnissen eine Erklärung dafür, wie dieses Problem von der Natur gelöst wird: Sie definieren mit atomarer Präzision, wie ein von Transposonen abgeleitetes System DNA RNA-gesteuert bearbeitet. Transposons sind mobile genetische Elemente innerhalb von Bakterien. Eine Transposon-Linie kodiert für IscB, das weniger als halb so groß ist wie Cas9, aber gleichermaßen zur DNA-Bearbeitung fähig ist. Das Ersetzen von Cas9 durch IscB würde das Größenproblem endgültig lösen.

Die Veröffentlichung der Forscher, „Structural Basis for RNA-Guided DNA Cleavage by IscB-ωRNA and Mechanistic Comparison with Cas9“, wurde am 26. Mai in veröffentlicht Wissenschaft.

Die Forscher verwendeten Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), um das IscB-ωRNA-Molekül aus einem Transposon-System in hoher Auflösung sichtbar zu machen. Sie waren in der Lage, Schnappschüsse des Systems in verschiedenen Konformationszuständen aufzunehmen. Sie waren sogar in der Lage, schlankere IscB-Varianten zu entwickeln, indem sie unwesentliche Teile von IscB entfernten.

„Ausgefallene Anwendungen der nächsten Generation erfordern, dass der Geneditor mit anderen Enzymen und Aktivitäten fusioniert wird, und die meisten Cas9s sind bereits zu groß für die virale Übertragung. Wir stehen am Ende der Übertragung vor einem Stau“, sagte die korrespondierende Autorin Ailong Ke, Professorin für Molekulare Biologie und Genetik am College of Arts and Sciences. „Wenn Cas9s in virale Vektoren verpackt werden können, die seit Jahrzehnten auf dem Gebiet der Gentherapie verwendet werden, wie AAV, dann können wir sicher sein, dass sie geliefert werden können, und wir können uns ausschließlich auf die Wirksamkeit des Bearbeitungswerkzeugs selbst konzentrieren.“

CRISPR-Cas9-Systeme verwenden eine RNA als Leitfaden, um eine DNA-Sequenz zu erkennen. Wenn eine Übereinstimmung gefunden wird, schneidet das Cas9-Protein die Ziel-DNA genau an der richtigen Stelle ab; Es ist dann möglich, eine Operation auf DNA-Ebene durchzuführen, um genetische Krankheiten zu beheben. Die vom Cornell-Team gesammelten Kryo-EM-Daten zeigen, dass das IscB-ωRNA-System auf ähnliche Weise funktioniert, wobei seine kleinere Größe dadurch erreicht wird, dass Teile des Cas9-Proteins durch eine strukturierte RNA (ωRNA) ersetzt werden, die mit der Leit-RNA fusioniert ist. Indem Proteinkomponenten des größeren Cas9 durch RNA ersetzt werden, wird das IscB-Protein auf die zentralen chemischen Reaktionszentren geschrumpft, die die Ziel-DNA abschneiden.

„Es geht darum, die Struktur der Moleküle zu verstehen und wie sie die chemischen Reaktionen durchführen“, sagte Erstautor Gabriel Schuler, Doktorand im Graduiertenbereich Mikrobiologie. „Das Studium dieser Transposons gibt uns einen neuen Ausgangspunkt, um leistungsfähigere und zugänglichere Werkzeuge zur Genbearbeitung zu entwickeln.“

Es wird angenommen, dass Transposons – mobile genetische Elemente – die evolutionären Vorläufer von CRISPR-Systemen waren. Sie wurden von der Nobelpreisträgerin Barbara McClintock entdeckt.

„Transposons sind spezialisierte genetische Anhalter, die sich ständig in unsere Genome integrieren und aus ihnen herausspleißen“, sagte Ke. „Insbesondere die Systeme in Bakterien werden ständig ausgewählt – die Natur hat im Grunde Milliarden Male gewürfelt und wirklich leistungsstarke DNA-chirurgische Werkzeuge entwickelt, einschließlich CRISPR. Und jetzt, indem wir diese Enzyme in hoher Auflösung definieren, können wir sie nutzen Kräfte.“

So klein IscB im Vergleich zu CRISPR Cas9 ist, glauben die Forscher, dass sie es noch kleiner schrumpfen können. Sie haben bereits 55 Aminosäuren entfernt, ohne die Aktivität von IscB zu beeinträchtigen; Sie hoffen, zukünftige Versionen dieses Genom-Editors noch kleiner und damit noch nützlicher zu machen.

Ein besseres Verständnis der Funktion der begleitenden Leit-RNA war eine weitere Motivation hinter der Studie, sagte Co-Erstautor Chunyi Hu, Postdoktorand in der Abteilung für Molekularbiologie und Genetik. „Es gibt noch viele Rätsel – zum Beispiel, warum Transposons ein RNA-gesteuertes System verwenden? Welche anderen Rollen spielt diese RNA möglicherweise?“

Eine Herausforderung, die den Forschern noch bleibt, ist, dass die IscB-ωRNA zwar in Reagenzgläsern extrem aktiv ist, aber bei der Veränderung der DNA in menschlichen Zellen nicht so effizient war. Der nächste Schritt ihrer Forschung wird darin bestehen, die Molekülstruktur zu nutzen, um die Möglichkeiten zu untersuchen, die sie für die Ursache der geringen Aktivität in menschlichen Zellen identifiziert haben. „Wir haben einige Ideen, sogar viele davon, die wir in naher Zukunft unbedingt testen möchten“, sagte Schuler.