Die reversible chemoenzymatische Markierungsstrategie ermöglicht eine eingehende Analyse der Protein-O-GlcNAcylierung

O-verknüpftes β-N-Acetylglucosamin (O-GlcNAcylierung), eine wichtige posttranslationale Modifikation (PTM) von Proteinen, ist an verschiedenen biologischen Funktionen beteiligt.

Die reversible Modifikation von O-GlcNAc verleiht während biologischer Prozesse On-Off-Proteinfunktionen. Aberrationen der O-GlcNAcylierung sind eng verbunden mit vielen Stoffwechselerkrankungen zusammen mit der Invasion und Metastasierung mehrerer Tumoren.

Kürzlich hat ein Forschungsteam unter der Leitung von Prof. Ye Mingliang und Prof. Qin Hongqiang vom Dalian Institute of Chemical Physics (DICP) der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (CAS) in Zusammenarbeit mit Prof. Huang Wei vom Shanghai Institute of Materia Medica von CAS, entwickelten eine neue Strategie zur reversiblen chemoenzymatischen Markierung von O-GlcNAc-Glykopeptiden, die eine eingehende Analyse der Protein-O-GlcNAcylierung ermöglichte.

Ihre Ergebnisse wurden in veröffentlicht Angewandte Chemie am 14. März.

Um die proteomweite Analyse der O-GlcNAcylierung zu ermöglichen, ist es wichtig, Glykopeptide aus den Verdaus komplexer Proben selektiv anzureichern.

Viele Forscher haben die Anreicherung von O-GIcNAcylierten Peptiden vor der Analyse durch Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) angestrebt. Die meisten Ansätze leiden jedoch unter einer schwachen Bindungsaffinität oder sperrigen Tags, die die Anreicherung und Identifizierung von O-GIcNAcylierten Peptiden stören.

In dieser neu entwickelten Strategie wurden die O-GlcNAc-Einheiten mit langen N-Glykanen unter Verwendung einer Endo-M-Mutante ligiert, was die Anreicherung der markierten Glykopeptide durch Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) ermöglichte. Dann wurden die angehefteten Glykane an den angereicherten Glykopeptiden durch Wildtyp-Endo-M/S entfernt, um die O-GlcNAc-Einheit wiederherzustellen.

Verglichen mit der klassischen chemoenzymatischen Markierung ermöglichte dieser Ansatz die Tag-freie Identifizierung und eliminierte die Interferenz voluminöser Tags beim Glykopeptidnachweis.

Darüber hinaus identifizierten die Forscher mit dieser Methode 657 potenzielle O-GlcNAc-Glykosite aus nur 0,4 mg HeLa-Zellkernproteinen, was nur 1/10 der Proteinproben für eine vergleichbare O-GlcNAcylierungsanalyse benötigte, was auf die hohe Empfindlichkeit hinweist Methode.

Insgesamt identifizierten sie 1.414 Glykosite aus nur 1,1 mg Proteinproben, und 45 % davon waren in den letzten 35 Jahren nicht in O-GlcNAcAltas aller menschlichen Proben enthalten, was die Analyseabdeckung der Protein-O-GlcNAcylierung verbesserte.

„Diese tagfreie Anreicherungsstrategie stellt einen einzigartigen Weg für die proteomweite Analyse der O-GlcNAcylierung dar und fördert die Mechanismusstudien“, sagte Prof. Ye.