Die kohärente Raman-Mikroskopie könnte durch die Fusion von Instrumenten und Computern erweitert werden

Raman-Streuung ist ein inelastischer Streuprozess, der Energien zwischen Photonen und Molekülen austauscht, um Informationen über Molekülschwingungen zu übertragen. Die Raman-Mikrospektroskopie ist zu einem unverzichtbaren Analysewerkzeug in der Biologie und medizinischen Chirurgie geworden, hauptsächlich aufgrund ihrer zwei „Freiheiten“: frei von Markierungen und frei von Wasserhintergrund.

Diese Vorteile ermöglichen es uns, lebende Proben ohne endogene Störungen zu untersuchen. Darüber hinaus haben Raman-Peaks eine viel schmalere spektrale Bandbreite als das Emissionsspektrum von Fluoreszenzfarbstoffen, was die gleichzeitige Untersuchung verschiedener Stoffwechselarten in derselben Umgebung ermöglicht.

In einem neuen Artikel, erschienen in eLightüberprüften Dr. Haonan Lin und Professor Ji-Xin Cheng von der Boston University die Kombination von instrumentellen und rechnerischen Ansätzen zur kohärenten Raman-Streuung (CRS).

Trotz ihrer erheblichen Vorteile liegt ein grundlegender Nachteil der Raman-Streuung in ihren stark begrenzten Wirkungsquerschnitten. Ein typischer Raman-Querschnitt beträgt 10–30 cm2 pro Molekül, was zu einer sehr langen Signalintegrationszeit von Sekunden bis Minuten pro Brennpunkt führt. Eine solche begrenzte Geschwindigkeit macht es unpraktisch, eine Pixel-für-Pixel-Bildgebung dynamischer Systeme durchzuführen. Ein nichtlinearer optischer Prozess wurde eingeführt, um die Raman-Signale kohärent zu verstärken und die fundamentalen Querschnittsgrenzen zu durchbrechen.

Mit zwei synchronisierten ultraschnellen Lasern entstanden kohärente Raman-Signale in kohärenter Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und stimulierter Raman-Streuung (SRS). Bei CRS interagieren zwei Laserfelder synchron mit dem Zielmolekül. Wenn die Schwebungsfrequenz mit dem Raman-Schwingungsmodus übereinstimmt, findet ein kohärent verstärkter Energieübertragungsprozess statt. Es vernichtet das Pumpphoton, wandelt es in den Stokes-Strahl um und erzeugt Photonen mit einer neuen Frequenz.

CRS hat eine chemische Hochgeschwindigkeitsbildgebung basierend auf intrinsischen Raman-Peaks auf biologischen Proben ermöglicht. Biologische Proben sind jedoch anspruchsvolle Mikrosysteme, die aus verschiedenen Metaboliten bestehen, die häufig spektrale Überlappungen aufweisen, insbesondere in der starken, aber überfüllten Kohlenstoff-Wasserstoff (CH)-Region.

Es behindert die Quantifizierung und Identifizierung von Chemikalien in Zellen und Geweben mit Schmalband-Einfarben-CRS. In den vergangenen Jahren wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um hyperspektrale CRS zu entwickeln, die an jedem Pixel ein Raman-Spektrum erzeugen.

Hyperspektrale Bilder bieten das Potenzial, Informationen über chemische Zusammensetzungen und Häufigkeiten in einer komplexen Umgebung zu entschlüsseln. Aufgrund der hohen Dimensionalität des Rohbildes sind solche Informationen jedoch nicht ohne weiteres verfügbar. Algorithmen sind erforderlich, um die wichtigsten reinen Komponenten zu identifizieren und Konzentrationskarten zu zerlegen.

Parallel zu den Instrumentierungsentwicklungen bei hyperspektralen CRS wurde über verschiedene Entmischungsverfahren für hyperspektrale Bilder berichtet. Je nachdem, ob vorab Informationen über die Zusammensetzung reiner Komponenten gegeben werden, kategorisieren wir diese in überwachte oder unüberwachte Verfahren.

Instrumentelle Innovationen haben die CRS-Bildgebung auf eine Geschwindigkeit von bis zu 2 kHz Bildrate, eine spektrale Abdeckung von bis zu 3500 cm-1 und eine spektrale Erfassungsgeschwindigkeit von bis zu 5 µs pro Spektrum gebracht. Diese Bedingungen können jedoch aufgrund der durch die Empfindlichkeitsgrenze von CRS bestimmten physikalischen Grenze nicht gleichzeitig realisiert werden.

Beispielsweise wird eine weitere Erhöhung der Geschwindigkeit das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) des Aufbaus verschlechtern, wodurch es für biomedizinische Anwendungen unanwendbar wird. Unter der Einschränkung von Lichtschäden kann dieser Kompromiss als Gestaltungsraum vermittelt werden. Es ist eine Hyperebene, die sich mit drei Achsen schneidet, die Geschwindigkeit, spektrale Bandbreite und SNR darstellen. Die Optimierung der Instrumentierung ermöglicht es dem System, einen optimalen Zustandspunkt auf der Hyperebene zu erreichen, aber darüber hinaus zu gehen, bleibt eine Herausforderung.

Das Forschungsteam führte verschiedene Computermethoden ein, die verwendet werden, um die Grenzen der chemischen CRS-Mikroskopie zu erweitern. Dabei ist auf die anwendbare Bandbreite der Rechenalgorithmen zu achten, um Fehlinterpretationen der Messwerte zu vermeiden. Entscheidend ist, ob das Vorwärtsmodell den zugrunde liegenden physikalischen Prozess angemessen beschreiben kann. Es umfasst die statistische Verteilung des Messrauschens, den Bildfaltungskern des Abbildungssystems und andere Techniken.

Strenge Experimente sollten unternommen werden, um das Vorwärtsmodell zu charakterisieren und Modellparameter zu kalibrieren. Wenn frühere Modelle/Regularisierungen verwendet werden, ist ein umfassendes Verständnis des Signals erforderlich. Die Hyperparameter-Abstimmung für die vorherigen Modelle ist entscheidend, um korrekte Ergebnisse zu erzielen, und kann iterative Aktualisierungen und Validierungen erfordern.

Für Deep-Learning-Anwendungen ist zwar die Aufgabe einer ausgefeilten Modellierung des inversen Problems erleichtert, jedoch sind eine geeignete Auswahl von Netzwerkstrukturen und ausreichend große Trainings- und Validierungsdatensätze erforderlich.

Mit Blick auf die Zukunft erwartet das Forschungsteam, dass Fortschritte bei der Instrumentierung den Datendurchsatz in zeitlichen, räumlichen und spektralen Dimensionen weiter erhöhen werden. Sie sollten mehr Funktionen für Datenstrukturen wie Sparsity und Korrelation bieten. In der Zwischenzeit können neue Computermethoden genutzt werden, um die Kompromisse im Designraum zu überwinden und angereicherte chemische Zusammensetzungen für die biomedizinische Forschung bereitzustellen. Mit den schnellen Fortschritten in der computergestützten optischen Mikroskopie erwarten wir, dass mehr Ideen in CRS eindringen werden.

Da sich die meisten Rechenmethoden auf Weitfeldimplementierungen konzentrieren, ist die Übersetzung in die CRS-Mikroskopie nicht trivial. Umfangreiche Modellierung, Systemdesign und Algorithmusentwicklung müssen durchgeführt werden, um die Anwendbarkeit auf die CRS-Bildgebung sicherzustellen. In Zukunft werden computergestützte Methoden eine noch wichtigere Rolle spielen, da bestehende Methoden weiterhin brauchbar bleiben, um den neu geschaffenen Designraum zu stärken. Neue Methoden können entstehen, um Durchbrüche in Aspekten wie Sichtfeld, Abbildungstiefe und räumliche Auflösung zu erzielen.