Die Raman-Bildgebung bietet ein größeres Potenzial zum Nachweis mehrerer Enzymaktivitäten als die Fluoreszenz-Bildgebung, zeigen Forscher von Tokyo Tech durch die Entwicklung von 9CN-Rhodol-basierten aktivierbaren Raman-Sonden unter Verwendung eines neuartigen Mechanismus für die Raman-Signalaktivierung. Die Strategie ermöglicht die Synthese hochgradig aktivierbarer Raman-Sonden mit hoher Aggregations- und Multiplexing-Fähigkeit, was sie zu einem vielversprechenden Werkzeug zur Erweiterung des Spektrums von Raman-Sonden für den Nachweis multipler Enzymaktivitäten in heterogenen biologischen Geweben macht.
Die Beteiligung von Enzymen an einer Vielzahl biologischer Aktivitäten macht sie zu idealen Biomarkern für die Erkennung von Krankheiten. Tatsächlich verwenden krebsspezifische Diagnosetechnologien die Fluoreszenzbildgebung zum Nachweis hochregulierter krebsassoziierter Enzyme in den betroffenen Zellen. Da Tumorgewebe heterogen sind, könnte der gleichzeitige Nachweis mehrerer Enzymaktivitäten eine präzise Krebsvisualisierung und -diagnose ermöglichen. Die Unfähigkeit, mehrere Enzymaktivitäten nachzuweisen, kann jedoch möglicherweise die Anwendung der Fluoreszenzbildgebung in heterogenen Tumorgeweben und anderen komplexen biologischen Phänomenen einschränken.
Als Alternative bietet die schmalere spektrale Breite der Raman-Spektralbildgebung Hoffnung auf ein Multiplexing der biologischen Bildgebung mit molekularen Sonden. Im Laufe der Jahre wurden mehrere funktionelle und aktivierbare Raman-Sonden (Farbstoffe) zum Nachweis von Bioanalyten entwickelt, aber diejenigen zum Nachweis von Enzymaktivitäten waren begrenzt. Darüber hinaus konnten die früheren Designstrategien die Diffusion des enzymgenerierten Hydrolyseprodukts dieser Sonden nicht kontrollieren, was es schwierig macht, Regionen mit Zielenzymaktivität in Geweben zu unterscheiden.
Vor diesem Hintergrund berichtete ein Forscherteam aus Japan unter der Leitung von Professor Mako Kamiya und Assistant Professor Hiroyoshi Fujioka vom Tokyo Institute of Technology (Tokyo Tech) kürzlich, inspiriert von aggregationsbasierten Fluoreszenzsonden, über eine neue molekulare Designstrategie für die Synthese von aktivierbare Raman-Sonden auf Basis von 9CN-Rhodol. Ihre Studie wurde in der veröffentlicht Zeitschrift der American Chemical Society.
Prof. Kamiya erklärt die Wahl von Rhodol-Derivaten für molekulare Gerüste: „Hiroyoshi fand heraus, dass Rhodol-Derivate mit einer Nitrilgruppe an der neunten Position (9CN-Rhodole) und einer Nettoladung von null einen einzigen scharfen Raman-Peak aufweisen und eine höhere Aggregation aufweisen Fähigkeit in wässriger Lösung als 9CN-Pyronine mit positiver Ladung. Dementsprechend verwendeten wir 9CN-Rhodol-Gerüstfarbstoffe, um Raman-Sonden zu schaffen, die eine hohe Empfindlichkeit aufweisen und eine Rotverschiebung der molekularen Absorption in Richtung einer Region mit resonantem Raman-Effekt erfahren und bei Wechselwirkung mit Aggregaten bilden die Zielenzyme.“
Dementsprechend synthetisierte das Team zunächst 9CN-Rhodol-Derivate und wählte zwei Derivate, 9CN-JR und 9CN-JCR, als Kandidaten für die Entwicklung der aktivierbaren Raman-Sonden aus. Anschließend testeten sie die Enzymdetektionsleistung beider Sonden in lebenden Zellen unter Verwendung einer bildgebenden Technik mit zweifarbiger stimulierter Raman-Streuung (SRS). Von den beiden erwies sich 9CN-JCR als die bessere und hellere Sonde für das Multiplexen.
Als nächstes markierte das Team die Nitrilgruppe des 9CN-JCR-Gerüsts mit Kohlenstoff-13 (13C) und Stickstoff-15 (15N) isotopenmarkiert und erstellte dann zwei neue isotopeneditierte 9CN-JCR-Sonden für γ-Glutamyl-Transpeptidase und Dipeptidyl-Peptidase-4 Enzyme. Der neue Satz von 9CN-JCR-basierten Sonden war dann in der Lage, die Aktivitäten all dieser Enzyme gleichzeitig in der lebenden Zellkultur nachzuweisen.
Darüber hinaus ermöglichten die Sonden die Ex-vivo-Bildgebung verschiedener Zellregionen, die die Zielenzymaktivität in Drosophila-Flügelscheiben und -Fettkörpern exprimieren. Die hohe räumliche Selektivität und Empfindlichkeit der 9CN-JCR-Sonden wurde dem elektronischen Vorresonanzeffekt des Gerüstfarbstoffs und der Aggregatbildung der Hydrolyseprodukte zugeschrieben, die durch die Wechselwirkung zwischen Sonde und Zielzelle gebildet wurden.
Die auf Rhodol basierenden Sonden konnten bei der Reaktion mit den Enzymen aggregieren, ihre intrazelluläre Retention verbessern und die SRS-Signalintensität während des Enzymnachweises erhöhen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Studie gezeigte einfache Strategie die Entwicklung hochspezifischer aktivierbarer Raman-Sonden für den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Enzymaktivitäten erleichtern kann. „Unsere Strategie für das molekulare Design von Raman-Sonden auf Aggregationsbasis wird erhebliche Vorteile für Anwendungen bieten, bei denen es um die Untersuchung von Enzymaktivitäten im Zusammenhang mit Krankheiten und wesentlichen biologischen Aktivitäten geht“, schließt Prof. Kamiya.
Mehr Informationen:
Hiroyoshi Fujioka et al, Aktivierbare Raman-Sonden, die die enzyminduzierte Aggregatbildung für die selektive Ex-vivo-Bildgebung nutzen, Zeitschrift der American Chemical Society (2023). DOI: 10.1021/jacs.2c12381