Forscher der Universität Kanazawa berichten Kommunikationsbiologie dass die Verwendung üblicher Chemikalien zum Fixieren lebender Zellproben für Mikroskopiestudien dazu führt, dass Membranproteine aggregieren.
Für histologische Untersuchungen von biologischen Geweben, dh anatomische Untersuchungen unter dem Mikroskop, werden Proben üblicherweise fixiert, um sie vor Fäulnis zu schützen. Die Fixierung erfolgt in der Regel durch Eintauchen oder Perfundieren der Probe in einer Chemikalie – Aldehyde und Alkohole sind übliche Fixiermittel. Es wurde spekuliert, dass Membranproteine, die sich bis zu einem gewissen Grad auf einer Zellmembran bewegen, während der Fixierung Aggregate bilden können. Um endgültige Einblicke in dieses potenzielle Problem zu erhalten, sind jedoch detaillierte Zelloberflächenstudien mit einer Auflösung im Nanometerbereich erforderlich. Jetzt haben Takehiko Ichikawa und Kollegen von der Universität Kanazawa Rasterkraftmikroskopie-Studien (AFM) an Oberflächen von lebenden Säugetierzellen durchgeführt. Durch den Vergleich von nicht fixierten und fixierten Proben fanden sie heraus, dass die Fixierung tatsächlich zu strukturellen Veränderungen führt.
Die Forscher entwickelten eine Methode zur Verwendung einer mikroporösen Siliziumnitridmembran (MPM), die in der Transmissionselektronenmikroskopie (Abbildung 1) für die AFM-Bildgebung verwendet wird. Wichtig ist, dass MPM die Zelloberfläche flach machen und Schwankungen verhindern kann, indem es den Bereich außerhalb des Beobachtungsbereichs unterstützt. In AFM-Bildern der Oberflächen der kultivierten Dickdarmkrebszellen auf MPM zeigten sich biomolekulare Strukturen auf den Zellmembranen als Vorsprünge mit einer typischen Größe von wenigen Nanometern (Abbildung 2 lebende Zelloberfläche).
Wenn die Zellen mit gängigen Fixiermitteln wie Paraformaldehyd, Glutaraldehyd und Methanol behandelt wurden, verschwanden Strukturen von wenigen Nanometern, und es wurden nur große Vorsprünge mit Durchmessern im Bereich von 20 bis 100 Nanometern beobachtet (Abbildung 2). Die Forscher führten mehrere Fluoreszenzexperimente durch und kamen zu dem Schluss, dass große Vorsprünge, die nach der Fixierung beobachtet wurden, durch die Aggregation von Membranproteinen gebildet wurden.
Die Studie zeigt, dass die beobachteten Aggregate Artefakte sind, die aus dem Fixierungsprozess resultieren. Dies sollte in der Gemeinschaft der Forscher, die mit chemischen Fixiermitteln arbeiten, zur Vorsicht mahnen. Ichikawa und Kollegen zitieren: „Forscher, die nanoskalige Cluster beobachten, sollten auch bei der Interpretation ihrer experimentellen Ergebnisse vorsichtig sein, wenn sie fixierte Zellen verwenden. Wir empfehlen, dass Forscher so viel wie möglich lebende Zellen verwenden, um den Effekt der Fixierung bei der Untersuchung von nanoskaligen Clustern zu vermeiden.“
Das allgemeine Prinzip hinter der Rasterkraftmikroskopie (AFM) besteht darin, eine sehr kleine Spitze dazu zu bringen, die Oberfläche einer Probe abzutasten. Während dieses horizontalen (xy) Scans folgt die Spitze, die an einem kleinen Cantilever befestigt ist, dem vertikalen (z) Profil der Probe, wodurch eine messbare Kraft auf den Cantilever ausgeübt wird. Die Größe der Kraft an der xy-Position kann auf den z-Wert bezogen werden; Die bei einem Scan generierten xyz-Daten ergeben dann eine Höhenkarte, die strukturelle Informationen über die untersuchte Probe liefert. AFM wird durch die Beugungsgrenze aufgrund der Verwendung von Licht- oder Elektronenstrahlen nicht beeinflusst und kann die intakte Oberflächentopographie mit hoher Auflösung beobachten.
Takehiko Ichikawa et al, Chemische Fixierung erzeugt Nanocluster auf der Zelloberfläche durch Aggregation von Membranproteinen, Kommunikationsbiologie (2022). DOI: 10.1038/s42003-022-03437-2