CRISPR/Cas9 bleibt das leistungsfähigste Werkzeug zur Erzeugung von Mutationen im Pflanzengenom. Die Untersuchung der verschiedenen Kombinationen von Mutationen hat den Umfang der Versuchsaufbauten erheblich vergrößert und erfordert mehr Platz für den Anbau zahlreicher Pflanzen.
Forscher des VIB-UGent Center for Plant Systems Biology haben die Multiplex-Mutagenese verbessert, was die Komplexität und Kosten groß angelegter Genomeditierungsprojekte reduziert. Ihre Ergebnisse waren veröffentlicht In Das Pflanzenjournal.
Der Umfang der CRISPR/Cas-Experimente nimmt ständig zu, nicht nur im Hinblick auf die Anzahl der Mutanten, die durch präzise Genombearbeitung entstehen, sondern auch im Hinblick auf die Anzahl der Gene, die gleichzeitig mutiert werden können. Das Labor von Thomas Jacobs vom VIB-UGent Center for Plant Systems Biology hat Screens entwickelt, um Dutzende, Hunderte oder sogar Tausende von Genen gleichzeitig systematisch zu mutieren.
Ziel ist es, die Effizienz vererbbarer Keimbahnmutationen zu steigern und letztendlich die Komplexität und Kosten groß angelegter Genom-Editierungsprojekte zu reduzieren.
Um dies zu erreichen, konzentrierte sich das Team auf zwei Schlüsselaspekte des CRISPR/Cas9-Vektordesigns: den Promotor zur Steuerung der Cas9-Expression und die Kernlokalisierungssignale (NLS), die das Protein zum Zellkern leiten. Durch die Genotypisierung Tausender Arabidopsis-Pflanzen fanden sie heraus, dass die Verwendung des RPS5A-Promotors zur Expression von Cas9 zur höchsten Mutationsrate führte und dass die Flankierung des Cas9-Proteins mit zweiteiligen NLS die effizienteste Konfiguration zur Erzeugung von Keimbahnmutationen war.
Die Kombination dieser beiden Elemente führt zur höchsten beobachteten Multiplex-Editierungseffizienz, wobei 99 % der Pflanzen mindestens eine Knockout-Mutation und über 80 % 4 bis 7 Mutationen aufweisen.
„Dies stellt einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der Pflanzengenetik dar und stellt ein zuverlässiges und effizientes Werkzeug für Forscher dar, die sich auf komplexe Gentechnik konzentrieren. Was ich besonders interessant finde, ist die Wirkung des NLS. Ich vermute, dass es eine stärkere Wirkung hatte als die Förderung.“ „, sagte Dr. Thomas Jacobs, Gruppenleiter am VIB-UGent Center for Plant Systems Biology
Die in der Studie erzielten Optimierungen reduzieren die Komplexität und Kosten groß angelegter Genomeditierungsprojekte in der Pflanzenwissenschaft erheblich. Um es in Zahlen auszudrücken: Mit ihrem vorherigen Vektor erforderte ein CRISPR-Screening, bei dem nach allen Doppel-Knockouts von nur 20 Genen gesucht wurde, schätzungsweise eine Population von etwa 18.000 Pflanzen. Mit den neuen Vektoren dürften es etwa 3.000 Pflanzen sein.
„Diese Optimierungen werden nützlich sein, um Knockouts höherer Ordnung in der Keimbahn von Arabidopsis zu erzeugen, und werden wahrscheinlich auch auf andere CRISPR-Systeme anwendbar sein“, sagte Ward Develtere, Ph.D. Student und Hauptautor des Berichts.
Mehr Informationen:
Ward Develtere et al., Kontinuierliche Verbesserung der CRISPR-induzierten Multiplex-Mutagenese bei Arabidopsis, Das Pflanzenjournal (2024). DOI: 10.1111/tpj.16785