Harvard-Wissenschaftler haben eine neue Technik namens Expansion-in-situ-Genomsequenzierung (ExIGS) vorgestellt, die bestehende In-situ-Genomsequenzierung (IGS) mit Expansionsmikroskopie (ExM) kombiniert. Die Innovation ermöglichte es Forschern, durch präzise Messungen der DNA-Protein-Wechselwirkungen im Nanometerbereich Zellkernanomalien mit Veränderungen der Genregulation innerhalb einer einzelnen Zelle in Verbindung zu bringen.
Die Mikroskopie ist ein wesentliches Instrument zur Charakterisierung der Zellfunktion. Bildgebende Methoden sind durch die Beugungsgrenze der optischen Mikroskopie begrenzt, was eine zuverlässige Messung auf der Skala von DNA-Protein-Wechselwirkungen verhindert.
Die Expansionsmikroskopie ist eine clevere Technik, die das Problem überwindet, Dinge zu sehen, die durch die Beugungsgrenze verborgen bleiben, indem sie sie vergrößert. Indem die Probe in ein quellbares Polymergel eingebettet und expandiert wird, können Forscher mithilfe herkömmlicher Mikroskope hochauflösende Bilder von räumlichen Organisationen innerhalb von Zellen erhalten.
Bei ExIGS wird die Expansionsmikroskopie mit der In-situ-Genomsequenzierung integriert, um gleichzeitig genomische DNA zu sequenzieren und Kernproteine in einzelnen Zellen mit nanoskaliger Auflösung abzubilden.
Der Prozess beginnt mit der Einbettung fixierter Zellen in ein Gel auf Polyacrylatbasis, das als Gerüst für die Expansion dient. Genomische DNA und Proteine werden mithilfe von DNA-Oligo-Haken, die an DNA-Haarnadeln binden, die an genomischen Fragmenten und Proteinen befestigt sind, chemisch mit dem Gel verbunden. Diese Haken enthalten chemische Gruppen, die während der Polymerisation kovalente Bindungen mit dem Gel eingehen.
Nach dem Einbetten polymerisiert das Gel um die fixierten Zellbestandteile herum und immobilisiert die DNA und Proteine. Durch Zugabe von Wasser quillt das Gel gleichmäßig um etwa das 4,5- bis 5,5-fache in alle Richtungen. Durch diese Expansion wird die Zelle physikalisch vergrößert, während die räumlichen Beziehungen zwischen den Molekülen erhalten bleiben. Um die Integrität der neu expandierten Struktur aufrechtzuerhalten, wird die Probe anschließend erneut in ein sekundäres, nicht expandierbares Acrylamidgel eingebettet.
Die erweiterte Probe wird einer hochauflösenden Immunfluoreszenzbildgebung unterzogen, die eine detaillierte Visualisierung der Kernproteine ermöglicht. Anschließend wird eine Rolling-Circle-Amplifikation durchgeführt, um klonale DNA-Amplikons zu erzeugen, die in situ sequenziert werden. Diese Amplifikation gewährleistet eine genaue Sequenzierung und Lokalisierung der genomischen DNA im erweiterten Zellkern.
Die Forscher beschreiben die Prüfung ihrer Innovation in einem Preprint Papier„Expansion in situ Genomsequenzierung verbindet nukleare Anomalien mit Hotspots einer aberranten Euchromatin-Repression“, auf dem bioRxiv Preprint-Server.
Durch die Anwendung von ExIGS auf Fibroblastenzellen eines Patienten mit Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom identifizierten die Forscher Unregelmäßigkeiten in Kernlaminen (Proteine, die dem Zellkern Struktur verleihen), die Hotspots abnormaler Repression in aktiven Genomregionen erzeugen und möglicherweise die Zellidentität gefährden.
Die Studie zeigte, dass ExIGS die Anzahl der Genom-Reads pro Zellkern deutlich erhöht und die 3D-Genomstruktur vergleichbar mit Hi-C-Sequenzierungsdaten bewahrt.
Die Technik bietet eine leistungsstarke neue Plattform zur Erforschung von DNA-Protein-Wechselwirkungen und ermöglicht Forschern einen beispiellosen Einblick in die molekularen Mechanismen. Es könnte unser Verständnis eines breiten Spektrums von Krankheiten und genetischen Störungen erheblich verbessern, die verborgenen Wechselwirkungen der Zellalterung beim Altern aufdecken und zu einer bahnbrechenden Technologie in biotechnologischen Forschungslabors werden.
Weitere Informationen:
Ajay S. Labade et al., Expansionin-Situgenomsequenzierung verbindet nukleare Anomalien mit Hotspots einer aberranten Euchromatin-Repression, bioRxiv (2024). DOI: 10.1101/2024.09.24.614614
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