Die Bestimmung der Struktur kleiner RNAs könnte zukünftige Therapeutika informieren

Eine neue Methode ermöglicht es Forschern, die Struktur und Häufigkeit von „Transfer-RNAs“ (tRNA) – kleinen, hochstrukturierten und chemisch modifizierten RNAs, die an der Proteinproduktion beteiligt sind – in lebenden Zellen zu bestimmen. Die Fehlfaltung von tRNAs wurde mit menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht, die von Krebs bis zu Typ-2-Diabetes und neurologischen Störungen reichen. Die neue Methode, die auch zeigt, wie sich die tRNA-Struktur verändern kann, wenn die Zellen durch hohe Temperaturen gestresst werden, ein gemeinsamer Stressfaktor, dem Pflanzen, Bakterien und sogar Menschen ausgesetzt sind, könnte möglicherweise die Entwicklung von Therapeutika für RNA-bedingte Krankheiten beeinflussen und ist anwendbar auf andere kleine, stark modifizierte RNA-Typen.

Ein Papier, das die Methode beschreibt, die von Forschern der Penn State entwickelt wurde, erscheint diese Woche in der Zeitschrift, Proceedings of the National Academy of Sciences.

„Vor etwa acht Jahren hat unser Team eine Methode namens „Structure-seq“ entwickelt, die chemische Modifikationen und Hochdurchsatz-Sequenzierung verwendet, um die Struktur von Boten-RNAs in vivo zu bestimmen“, sagte Philip Bevilacqua, angesehener Professor für Chemie und Biochemie und Molekulare Biologie an der Penn State und Leiter des Forschungsteams. „Wir haben diese Methode hier erweitert, um die Herausforderung zu bewältigen, mit kleineren RNAs zu arbeiten, die sehr stabile Strukturen haben und von Natur aus stark mit chemischen Tags wie tRNA modifiziert sind.“

RNA ist der DNA in vielerlei Hinsicht ähnlich. Beide sind lange Moleküle, die aus kleinen Einheiten bestehen, die „Basen“ oder „Nukleotide“ genannt werden und in der DNA durch A, T, C und G dargestellt werden (das T wird in der RNA durch U ersetzt). Aber wo DNA doppelsträngig ist – zwei lange Moleküle, die nebeneinander laufen und durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Einheiten verbunden sind – ist RNA nur ein Einzelstrang. Dieser Unterschied ist wesentlich, da RNA-Moleküle ihre Struktur erhalten, indem sie sich auf sich selbst zurückfalten und kurze Abschnitte bilden, in denen sich die Einheiten wie doppelsträngige DNA verbinden, aber mit einzelsträngigen Segmenten durchsetzt sind, die Schleifen und Ausbuchtungen bilden.

Die allgemeine Struktur der tRNA wurde in den 1960er und 70er Jahren bestimmt und wird klassischerweise als Kleeblatt mit drei Schleifen beschrieben, die durch doppelsträngige Segmente um einen zentralen Knoten herum verbunden sind. Es gibt Dutzende von tRNA-Typen, die sich in ihrer Sequenz nur geringfügig unterscheiden. Jede Art von tRNA entspricht einer bestimmten Aminosäure – den Bausteineinheiten von Proteinen – und ihre Strukturen sind entscheidend für ihre Funktion, die Aminosäuren an den Ort der Proteinproduktion in der Zelle zu transportieren.

„Wir können die Struktur von RNA-Molekülen basierend auf ihrer Sequenz vorhersagen und indem wir die Moleküle mit der Chemikalie Dimethylsulfat (DMS) modifizieren, die bestimmten Nukleotiden, die in der Struktur exponiert sind, eine andere chemische Markierung hinzufügt“, sagte Ryota Yamagami, ein Postdoktorand Forscher an der Penn State zum Zeitpunkt der Forschung und jetzt Assistenzprofessor an der Ehime University in Japan. „Da tRNAs klein und bereits stark modifiziert sind, was Probleme bei der Sequenzierung verursachen kann, mussten wir Methoden entwickeln, um sicherzustellen, dass wir die Moleküle in voller Länge erfassen.“

Yamagami erklärte, dass bei ihrer Methode lebende Zellen mit DMS behandelt werden, dann RNA aus den Zellen extrahiert und nach Größe selektiert wird, um die tRNA zu isolieren. Für die Sequenzierung müssen DNA-Kopien der RNA-Moleküle angefertigt werden. Dazu werden zunächst kleine DNA-Abschnitte, sogenannte Primer, an einem Ende der RNA-Moleküle befestigt, was verhindert, dass Informationen aus der kurzen RNA-Sequenz verloren gehen. DNA-Kopien werden dann mit einer speziellen Version des Enzyms „Reverse Transkriptase“ erstellt, die unter bestimmten Bedingungen nicht durch chemische Modifikationen der Nukleotide gestoppt wird, sondern häufig Fehler einführt, wenn es sich um ein modifiziertes Nukleotid handelt. Die Forscher verwenden diese Fehler dann, um zu identifizieren, welche Nukleotide modifiziert wurden – ein Prozess, der als „Mutationsprofilierung“ bezeichnet wird – um bei ihren Strukturvorhersagen zu helfen.

„Mit dieser Methode erhalten wir hochgenaue Strukturvorhersagen auf der Ebene einzelner Moleküle“, sagt Bevilacqua. „Dies ermöglicht uns auch, die Häufigkeit jeder Art von tRNA in der Zelle und das Vorhandensein einiger natürlicher Modifikationen zu bestimmen, die für die effiziente Produktion von Proteinen und die allgemeine Gesundheit der Zelle wichtig sein können.“

Die Identifizierung und Fülle natürlicher Modifikationen wurde von Jacob Sieg, einem Chemie-Doktoranden im Bevilacqua-Labor, durch Experimente in den Penn State Huck Institutes der Life Sciences Metabolomics Core Facility ausgearbeitet.

Die Forscher führten diese Experimente in Bakterienzellen durch, die bei normalen Temperaturen kultiviert wurden, in Zellen, die bei hoher Temperatur kultiviert wurden (Hitzestress) und in Zellen, die einem kurzen Ausbruch hoher Temperatur ausgesetzt waren (Hitzeschock). Sowohl unter Hitzestress als auch unter Schockbedingungen wurden mehrere Arten von tRNA-Molekülen falsch gefaltet und die relative Häufigkeit und Form verschiedener tRNAs verändert.

„Das Konzept, dass selbst eine hochstrukturierte RNA wie tRNA konformativ auf Umweltbedingungen reagiert, ist ein aufregendes Ergebnis dieser Studie“, sagte Sarah M. Assmann, Waller-Professorin für Biologie und Autorin der Studie. „Es erweitert unser grundlegendes Verständnis darüber, wie Zellen auf ihre Umgebung und Stress reagieren, und dieses Wissen könnte dazu beitragen, die Entwicklung neuartiger Interventionen zu unterstützen.“

Die neue Methode mit dem Namen „tRNA-Struktur-Seq“ könnte verwendet werden, um die Struktur kleiner RNAs im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten zu untersuchen, und ist nicht auf tRNA beschränkt.

„Zu sehen, wie tRNA-Moleküle auf diesen Stress und darüber hinaus reagieren, wird uns helfen, besser zu verstehen, wie Zellen auf Stress reagieren, und könnte uns auch dabei helfen, Krankheiten zu verstehen, die mit tRNA-Fehlfaltung zusammenhängen“, sagte Bevilacqua. „Diese neue Methode überwindet die Schwierigkeiten bei der Arbeit mit kleinen, stark modifizierten RNA-Molekülen und kann auf jeden Organismus und auf andere kleine RNAs angewendet werden.“