Pilze kommen häufig sowohl um Pflanzengewebe herum als auch in ihnen vor (insbesondere in Wurzeln) und sind sowohl an der Nährstoffaufnahme der Pflanze als auch an der Resistenz gegen Krankheitserreger beteiligt. Daher hat die Charakterisierung der Vielfalt und Zusammensetzung pflanzenassoziierter Pilzgemeinschaften in den letzten Jahren ein wachsendes Interesse geweckt.
Hochdurchsatzsequenzierung (HTS), auch Metabarcoding genannt, hat sich zu einem wichtigen Instrument zur Beurteilung komplexer mikrobieller Gemeinschaften aus Umweltproben entwickelt. Allerdings ist die Anwendung von HTS auf pflanzenassoziierte Pilzgemeinschaften aufgrund der Co-Amplifikation von Pflanzen- und Pilz-DNA eine Herausforderung. Pilzspezifische Primer, Peptid-Nukleinsäure-(PNA)-Klammern oder die Anpassung von PCR-Bedingungen werden als effiziente Ansätze zur Begrenzung der Pflanzen-DNA-Kontamination beschrieben.
Diese von Dr. Coralie Bertheau (Université de Franche-Comté) geleitete Studie bewertete die kombinierten Auswirkungen von Primerpaaren, der damit verbundenen Annealing-Temperatur (Ta) und PNA-Klammern bei der Bestimmung der Diversität und Zusammensetzung der Pilzgemeinschaft im Zusammenhang mit Pflanzenwurzeln.
Drei Primer (fITS7/ITS4, gITS7/ITS4 und 5.8S-Fun/ITS4-Fun), die auf die ribosomale interne transkribierte Spacer (ITS) 2-Region abzielen, wurden allein oder in Kombination mit PNA-Klammern jeweils an der Wurzel-DNA der Brennnessel (Urtica dioica) evaluiert und eine Scheinpilzgemeinschaft.
Das Team stellte fest, dass PNA-Klemmen den Reichtum oder die Vielfalt der Pilzgemeinschaften nicht verbesserten, sondern die Anzahl der Pilzarten erhöhten. Unter den getesteten Faktoren war das Primerpaar der wichtigste. Insbesondere das Paar 5.8S-Fun/ITS4-Fun zeigte einen höheren OTU-Anteil, aber weniger Pilzwerte.
„Die Ergebnisse zeigten, dass die Wahl der Primer entscheidend für die Begrenzung der Co-Amplifikation von Pflanzen- und Pilz-DNA ist. PNA-Klammern erhöhen die Anzahl der Pilz-Reads, wenn auf ITS2 abgezielt wird, führen jedoch nicht zu einer höheren Wiederherstellung der Pilzdiversität bei hoher Sequenzierungstiefe. Bei niedrigerem Read In großen Tiefen könnten PNA-Klemmen die Quantifizierung der mikrobiellen Diversität für Primerpaare ohne Pilzspezifität verbessern“, sagte Dr. Coralie Bertheau.
Die Arbeit ist veröffentlicht im Tagebuch Pilzkunde.
Mehr Informationen:
Chloé Viotti et al., Primerpaare, PCR-Bedingungen und Peptid-Nukleinsäureklammern beeinflussen die Beurteilung der Pilzvielfalt aus Pflanzenwurzelgeweben, Pilzkunde (2024). DOI: 10.1080/21501203.2023.2301003
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