Der Durchbruch in der CRISPR-Forschung könnte zu einer effektiveren und sichereren Genbearbeitung führen

Vor 10 Jahren erlebten wir einen Durchbruch in der modernen Biologie.

Ein amerikanischer Wissenschaftler entdeckte, dass die Manipulation des Cas9-Proteins zu einer Gentechnologie führte, die eines Science-Fiction-Films würdig ist: CRISPR.

Stellen Sie es sich als eine molekulare Schere vor, die in der Lage ist, die DNA von Menschen, Tieren, Pflanzen, Bakterien und Viren zu schneiden und zu editieren.

Das Potenzial ist riesig und reicht von der Beseitigung von Erbkrankheiten bis hin zur Produktion von Pflanzen, die dem Klimawandel standhalten.

Wie jede andere neue Technologie hatte auch CRISPR seine Herausforderungen. Eine der größten Herausforderungen bestand darin, die Technologie so effektiv wie möglich zu gestalten und sicherzustellen, dass die Schere nur dort schneidet, wo wir es wollen.

„Wir haben neue Mechanismen hinter CRISPR beschrieben“

Zwei neue Studien der Universität Kopenhagen, die zusammen mit Forschern der Universität Aarhus durchgeführt wurden, können helfen, diese Probleme zu lösen.

„Wir haben neue Mechanismen hinter CRISPR beschrieben“, sagt Professor für Bioinformatik Jan Gorodkin vom Fachbereich Veterinär- und Tierwissenschaften.

„Wir können jetzt erklären, warum einige Off-Targets, also unbeabsichtigte Schnitte an anderer Stelle im Genom, effektiver sind als On-Targets, also der Schnitt an der vorgesehenen Stelle -Target beeinflussen kann, wie effizient das Cas9-Protein die DNA schneidet. Hoffentlich wird dieses Wissen den Weg für eine effektivere und sicherere Anwendung von CRISPR ebnen.“

Wie funktioniert CRISPR? Zunächst entwirft ein Wissenschaftler ein Stück synthetischer RNA, die als Leit-RNA bezeichnet wird. Dieses wird dann an das Cas9-Protein gebunden, das die Aufgabe übernimmt, die DNA zu schneiden. Die Guide-RNA sucht nach dem passenden DNA-Abschnitt. Sobald die Leit-RNA die richtige Stelle gefunden hat, schneidet Cas9 den DNA-Strang. Jetzt kann der Wissenschaftler ein beliebiges synthetisches DNA-Stück in die frei gewordene Stelle einfügen.

Treffen Cas9 und die Leit-RNA das Ziel, sprechen die Wissenschaftler von „on target“; Wenn sie eine andere Stelle treffen, sind sie am Ziel vorbei.

Heute wird CRISPR im Kontext der Medizin hauptsächlich verwendet, um zu untersuchen, wie Gene und Medikamente im Labor funktionieren, und wird in der Behandlung von Menschen noch nicht weit verbreitet. Langfristig soll CRISPR jedoch zur Behandlung bestimmter genetischer Erkrankungen eingesetzt werden.

Rätsel um effektive Off-Targets gelöst

In einer der beiden neuen Studien versuchten die Forscher herauszufinden, wie sich die Leit-RNA am besten an die DNA anlagern kann, um den Schnitt so effektiv wie möglich zu gestalten – denn wenn der Schnitt nicht effektiv genug ist, werden die Wissenschaftler es nicht schaffen Bearbeiten Sie die DNA.

„Wir wissen bereits, dass CRISPR nicht wirklich funktioniert, wenn die Bindung zwischen der Leit-RNA und der DNA zu schwach ist. Jetzt haben wir gelernt, dass auch eine zu starke Bindung problematisch ist“, sagt Gorodkin. „In beiden Fällen ist die Genschere zu schwach und wirkungslos.“

Die Forscher identifizierten dann ein Intervall, in dem die Bindung zwischen der Leit-RNA und der DNA weder zu stark noch zu schwach ist, sondern genau richtig, was zu einer Schere mit perfekter Schärfe führt.

„Interessanterweise kann diese Beobachtung auch verwendet werden, um zu erklären, warum einige Off-Targets eine stärkere CRISPR-Aktivität zeigen als ihre beabsichtigten On-Targets – das heißt, warum die Schere für einige Off-Targets schärfer ist als für die On-Targets“, erklärt Gorodkin .

„Das liegt daran, dass zu starke On-Targets nicht in das richtige Bindungsenergieintervall fallen. Aber wenn Sie diesen starken Bindungen einen Teil der Energie entziehen, was an den Off-Target-Sites passiert, können Sie hineinkommen das Intervall rechts, was zu einer stärkeren Wirkung und damit zu einer Shaper-Scissor am Off-Target führt.

Die Studie hat auch die optimale Position des Cas9-Proteins identifiziert, um den effektivsten Schnitt zu erzielen.

Bevor Cas9 die DNA schneiden kann, muss das Protein an einen bestimmten Teil des DNA-Strangs binden. DNA besteht aus vier verschiedenen Nukleotiden: A, C, G und T, und Cas9 kann nur an eine Sequenz mit zwei aufeinanderfolgenden G-Nukleotiden binden.

Jetzt haben die Forscher die Wirkung mehrerer aufeinanderfolgender G-Nukleotide auf Cas9 identifiziert – eine Situation, in der es schwierig ist, das Ziel zu treffen, da jeweils zwei aufeinanderfolgende Gs um die Bindung mit Cas9 konkurrieren.

„Wenn es mehrere G’s ’stromaufwärts‘ gibt, d.h. vor der Sequenz, an die Cas9 binden sollte, wird der Schnitt effektiver sein. Aber wenn es mehrere G’s ’stromabwärts‘ gibt, d.h. nach der beabsichtigten Sequenz für Cas9 zu binden, ist der Schnitt weniger effizient“, erklärt Postdoc Giulia Corsi.

Corsi hofft, dass das neue Wissen über die Funktionsweise von CRISPR es in Zukunft einfacher machen wird, die richtige Position von Cas9 zu identifizieren. Dies sollte auch dazu beitragen, die Anzahl möglicher Nebenwirkungen zu minimieren.

„Wir möchten in der Lage sein, den Schnitt vorherzusagen, die Target-Bearbeitung zu verbessern und Off-Targets zu eliminieren, die die Entwicklung neuer Medikamente erschweren, weil sie viele Ressourcen erfordern und zu Nebenwirkungen führen können, die auftreten, wenn man das falsche Gen schneidet“, sagt er Korsi.

Off-Targets können schädlich sein – und sie sind zu wenig erforscht

Die zweite Studie konzentriert sich auf Off-Targets. Hier entwickelten die Forscher eine Methode zur Messung der Effektivität von Off-Targets.

Zur Qualitätskontrolle eines CRISPR-Experiments wählen Wissenschaftler normalerweise eine kleinere Anzahl von computervorhergesagten Off-Targets zum Testen aus. Mit der neuen Technologie werden sie jedoch in der Lage sein, eine viel größere Anzahl von Off-Targets zu testen, und es wird erwartet, dass dies die Entwicklung neuer Medikamente mit weniger Nebenwirkungen beschleunigen wird.

Mit der neuen Methode testeten die Forscher 8.000 potenzielle Off-Targets für 110 CRISPR-Leit-RNAs, die gerade in die Humanmedizin übersetzt werden. Sie fanden heraus, dass etwa 10 Prozent der 8.000 potenziellen Off-Targets tatsächlich Off-Targets waren.

„Wir haben viel mehr Off-Targets gefunden, als wir mit bestehenden Methoden hätten erreichen können“, erklärt Gorodkin.

Darüber hinaus befinden sich 37 dieser Off-Targets in krebsrelevanten Genen, was das Risiko erhöht, dass die Entwicklung von Medikamenten schwieriger oder sogar unmöglich wird. Darüber hinaus können unbeabsichtigte Schnitte in diesen Genen als mögliche Nebenwirkung sogar zu Krebs führen.

„Forscher müssen in der Lage sein, solche Off-Targets zu identifizieren und andere Guide-RNAs auszuwählen, die diese oder andere kritische Off-Targets nicht haben“, sagt Gorodkin.

Großer Bedarf an weiterer Erforschung von Off-Targets

Dies zeige laut Gorodkin, dass es einen großen Bedarf an weiterer Erforschung von Off-Targets gebe.

„Ich würde argumentieren – und einige mögen anderer Meinung sein – dass Off-Targets extrem wenig erforscht sind. Mein Eindruck ist, dass bestehenden Studien zur Genbearbeitung oft die vollständigen Werkzeuge und Analysen fehlen, die erforderlich sind, um zu zeigen, dass es in ihren Studien keine Off-Target-Effekte gibt ,“ er sagt.

Laut Jan Gorodkin wird die neue Methode in Zukunft große Auswirkungen haben, um Studien besser auf Off-Targets zu überprüfen.

„In den vergangenen 10 Jahren haben wir einen großen Schritt gemacht, um das Genom editieren zu können. Jetzt sind wir dabei, unsere Methoden besser, sicherer und effektiver zu machen. Letzteres unterstützt auch die grüne Wende, da Genommodifikationen, B. von in der Produktion eingesetzten Zellen, kann zu einer kostengünstigeren Nutzung von Ressourcen führen.“

Die beiden Studien sind veröffentlicht in Naturkommunikation.