Forscher der Indiana University Bloomington haben zuvor verborgene Schritte eines Gen-Silencing-Prozesses aufgedeckt, der zur Bekämpfung von Viren und anderen potenziellen Genom-Eindringlingen verwendet wird.
Die neuen Erkenntnisse, veröffentlicht in Gene & Entwicklung, berichten über die Arbeit eines Teams unter der Leitung von Erstautor Dr. Feng Wang im Labor des Distinguished Professor of Biology and Molecular and Cellular Biochemistry, Craig Pikaard. Die Studie zeigt, wie ein Mitglied einer wichtigen Proteinfamilie, ARGONAUTE 4 (AGO4), Schnipsel von Ribonukleinsäure (RNA)-Molekülen bindet, schneidet und zurückhält, die die chemische Inaktivierung von Genen mit übereinstimmenden Sequenzen steuern.
Das durch RNA-Moleküle vermittelte Gen-Silencing ist als RNA-Interferenz oder RNAi bekannt und tritt in verschiedenen Organismen auf, darunter Tiere, Insekten, Pflanzen und Pilze. Es gibt verschiedene Arten von RNAi, aber alle haben gemeinsame Merkmale. Alle beginnen mit RNA-Polymerase-Proteinen, die die in der DNA gespeicherte genetische Information lesen und sie in RNA kopieren, ein Prozess, der als Transkription bekannt ist.
Bei allen RNAi-Wegen werden doppelsträngige RNAs (dsRNAs) synthetisiert, wobei die beiden Stränge wie eine DNA-Doppelhelix gepaart sind. Diese dsRNAs werden von Dicer-Proteinen in kürzere dsRNAs geschnitten, deren einzelne Stränge je nach Spezies und RNAi-Weg zwischen etwa 21 und 35 Nukleotiden (den einzelnen Einheiten von RNA-Polymeren) liegen können. Die gewürfelten dsRNAs werden dann in ein Protein der Argonaute-Familie geladen. Nur ein Strang, der als Führungsstrang bekannt ist, ist dazu bestimmt, stabil mit dem AGO-Protein verbunden zu bleiben.
Der andere Strang, bekannt als Passagierstrang, wird freigesetzt und abgebaut. Das AGO-Protein verwendet dann den Leitstrang, um RNA-Ziele zu finden, mit denen sich der Leitstrang paaren kann, was auf verschiedene Weise zu einer Gen-Stummschaltung führt. In einem Szenario, das zur Inaktivierung von RNAs verwendet wird, die Proteine kodieren, programmiert der Guide AGO, um die Ziel-RNA in zwei Fragmente zu schneiden oder die Ziel-RNA von der Proteinsynthesemaschinerie abzusondern.
In einem alternativen Szenario findet die Paarung der Leit-RNA mit der Ziel-RNA statt, während die Ziel-RNA noch synthetisiert wird, und bewirkt die Rekrutierung von Proteinen, die das zu transkribierende Gen chemisch modifizieren. In verschiedenen Organismen, zu denen Pflanzen und Menschen gehören, umfassen diese Modifikationen das Hinzufügen von Methylgruppen mit einem einzigen Kohlenstoffatom zur transkribierten DNA, was zu Veränderungen in der Genorganisation führt, die weitere Transkriptionsrunden und RNA-Synthese verhindern.
In der neuen Studie haben Wang et al. untersuchten die Rolle von AGO4 in einem RNAi-Weg in Pflanzen, der als RNA-gerichtete DNA-Methylierung bezeichnet wird. Das Dicer-Enzym dieses Signalwegs erzeugt sowohl 23 als auch 24 Nukleotide (nt) RNAs, aber frühere Studien hatten nur 24 nt RNAs gefunden, die mit AGO4 assoziiert sind, was die Funktion der 23 nt RNAs unklar macht.
Eine Offenbarung kam aus der Analyse von Pflanzen, die so manipuliert wurden, dass sie AGO4 produzieren, das nicht in der Lage ist, Ziel-RNAs zu schneiden. In dieser Linie wurden sowohl 23- als auch 24-nt-RNAs gefunden, die mit AGO4 assoziiert sind. Dies legt nahe, dass 23 nt-RNAs normalerweise als Passagierstränge für 24 nt-RNAs dienen und dann in Scheiben geschnitten werden, eine Hypothese, die durch die Wiederholung der Reaktion im Reagenzglas gestützt wird.
Die Fragmente der geschnittenen 23-nt-RNAs wurden jedoch nicht wie erwartet freigesetzt. Stattdessen wurden sie von AGO4 zurückgehalten, sowohl in der Zelle als auch im Reagenzglas. Im Anschluss an diese Beobachtung stellten Wang und Kollegen fest, dass Ziel-RNA-Fragmente auch nach dem Schneiden von AGO4 zurückgehalten werden, was darauf hindeutet, dass diese Fragmente eine zuvor unerkannte Rolle bei der RNA-gesteuerten DNA-Methylierung spielen.
In Übereinstimmung mit dieser Idee stellten die Autoren fest, dass die RNA-Slicing-Aktivität von AGO4 erforderlich ist, um ein hohes Maß an DNA-Methylierung an Zielstellen im gesamten Genom zu erreichen. Die Autoren spekulieren, dass die zurückbehaltenen RNA-Fragmente dazu beitragen, AGO4-RNA-Komplexe an entsprechende DNA-Sequenzen zu binden, um die Effizienz der DNA-Methylierung zu steigern.
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Feng Wang et al., Enzymatische Reaktionen von AGO4 bei der RNA-gesteuerten DNA-Methylierung: siRNA-Duplex-Beladung, Passagierstrang-Eliminierung, Target-RNA-Slicing und Sliced-Target-Retention, Gene & Entwicklung (2023). DOI: 10.1101/gad.350240.122