In lebenden Organismen werden Proteinmoleküle mit unterschiedlichen chemischen Strukturen, sogenannte Proteoformen, von einem einzigen Gen produziert, um eine Vielzahl physiologischer Proteinfunktionen auszuführen. Es ist seit geraumer Zeit bekannt, dass der Mensch über etwa 22.000 Gene verfügt, die Gesamtzahl der menschlichen Proteoformen ist jedoch noch unbekannt.
Derzeit ist die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), eine hochempfindliche Methode zur Messung von Biomolekülen, die wichtigste Methode zur Analyse von Proteoformen. Während der traditionelle Ansatz zur Analyse von Proteoformen die Zerlegung in kleine Peptide erfordert, wird ein neuerer Ansatz zur Analyse intakter Proteoformen mittels LC-MS als Top-Down-Proteomik bezeichnet.
In Anlehnung an das Human Genome Project, das alle unsere Gene kartierte, gab es Versuche, mithilfe von Top-Down-Proteomik einen Atlas menschlicher Proteoformen zu erstellen. Allerdings sind die aus biologischen Proben extrahierten Proteoformkomponenten komplex und LC-MS allein kann nicht alle Proteoformen umfassend erfassen.
In 2020Die Takemori-Gruppe an der Ehime-Universität entwickelte ursprünglich PEPPI-MS, eine innovative Methode zur hochauflösenden Fraktionierung von Proteoformen mithilfe des kostengünstigen und einfachen SDS-PAGE-Systems. Durch die Probenfraktionierung mittels PEPPI-MS konnte die Anzahl der durch LC-MS nachweisbaren Proteoformen erheblich gesteigert werden, und ihre Leistung hat in vielen Top-Down-Proteomikstudien zur Verwendung von PEPPI bei der Probenvorbereitung, der sogenannten „Prä“-Fraktionierung, geführt .
In 2022In Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. Andreas Tholey an der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel wurde ein hochempfindliches Proteoform-Messsystem gebaut, das PEPPI-MS-Fraktionierung mit FAIMS-Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie kombiniert, die trennen kann Proteoformen in der Gasphase.
Mit diesem System, in 2023 Sie erreichten eine detaillierte Analyse menschlicher Zellkulturen mittels Top-Down-Proteomik und etablierten eine Methodik für eine neue Middle-Down-Proteomik, bei der die Glu-C-Verdauungsprodukte von Proteoformen analysiert werden.
Die PEPPI-MS-Fraktionierung erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann mit standardmäßiger biochemischer Laborausrüstung durchgeführt werden. Seine Einfachheit und Zugänglichkeit haben dazu geführt, dass es sich zu einer Standardmethode für die Probenfraktionierung in der Deep-Top-Down-Proteomik entwickelt hat.
Um die Proteoformanalyse weiter voranzutreiben, hat die Takemori-Gruppe kürzlich experimentelle Protokolle für die hochauflösende Proteoformfraktionierung unter Verwendung von PEPPI-MS und Top-Down/Middle-Down-Proteomik unter Verwendung des FAIMS-LC-MS-Systems erstellt veröffentlicht ein optimiertes Protokoll, das ihre Arbeit von 2020 bis 2024 bündelt Naturprotokolle.
Der vollständige Satz von PEPPI-MS-Protokollen ermöglicht die hochauflösende Fraktionierung von Spuren biologischer Proben und die groß angelegte Proteoformanalyse mittels LC-MS und soll zur Erstellung von Proteoformatlanten für verschiedene lebende Arten und zur Entwicklung krankheitsdiagnostischer Methoden beitragen auf präzise Proteoforminformationen.
Weitere Informationen:
Ayako Takemori et al., PEPPI-MS: gelbasierte Probenvorfraktionierung für tiefe Top-Down- und Middle-Down-Proteomik, Naturprotokolle (2025). DOI: 10.1038/s41596-024-01100-0