Das neue Gerätedesign bringt unvergleichliches Vertrauen in Zellmessungen

Die Messung der Anzahl und Eigenschaften von Zellen, die sich in einem Strom bewegen – ein Prozess, der als Durchflusszytometrie bezeichnet wird – ist von entscheidender Bedeutung für die diagnostische Medizin, die pharmazeutische Forschung und die biomedizinische Wissenschaft. Jetzt haben Forscher des National Institute of Standards and Technology (NIST) einen Weg gefunden, um beispiellose Verbesserungen an der Technik vorzunehmen.

Bei der Durchflusszytometrie werden Zellen typischerweise mit fluoreszierendem Material markiert, mit Laserlicht bestrahlt, wenn sie einen bestimmten Punkt in einem Flüssigkeitskanal von etwa der Größe eines menschlichen Haares überqueren – schmal genug, dass sich die Zellen im Allgemeinen im Gänsemarsch bewegen – und das von ihnen emittierte Licht aufgezeichnet die Marker auf der Zelle. Die Analyse der Emissionen offenbart verschiedene Merkmale wie Zelltyp, Größe, DNA-Gehalt und Stadium im Zellteilungszyklus.

Aber der konventionellen Einzelmessmethode fehlt ein Mittel, um die Schwankungen in ihren Messwerten zu quantifizieren. Beispielsweise kann ein Zytometer, das Krebs-Biomarker misst, anhand eines bestimmten Messwerts zwischen gesunden und kranken Zellen entscheiden. Eine Zelle kann einen etwas niedrigeren Wert zurückgeben und sie als gesund identifizieren. Aber der Wertebereich, den das Instrument für wiederholte Messungen dieser Zelle zurückgeben könnte, ist unbekannt.

Das ist problematisch, weil nicht bekannt ist, wie oft der Wert die Diagnose verfälschen könnte. Zum Beispiel ist ein hohes Vertrauen unerlässlich, wenn zirkulierende Tumorzellen gezählt werden, die zu Krebsmetastasen führen; In einer Blutprobe kommt möglicherweise nur eine Tumorzelle auf eine Million andere. Die Verbesserung der Fähigkeit, diese seltenen Ereignisse zu beheben, könnte zu einer früheren Erkennung und besseren Behandlungsoptionen führen.

In ähnlicher Weise können ungenaue Zählungen verschiedener Zellpopulationen, wie z. B. Immunzellen, in einer Probe zu einer falschen Diagnose einer Krankheit oder einer Fehlinterpretation des Erfolgs einer medikamentösen Behandlung führen. Es kann schwer zu sagen sein, ob sich unterschiedliche Messungen aus unterschiedlichen Zelltypen oder einfach aus experimenteller Variabilität ergeben.

Um dieser Situation zu begegnen, haben die NIST-Forscher ein neuartiges System entwickelt und validiert, das direkt das Ausmaß der Variation in durchflusszytometrischen Messungen aufzeichnet, um die Unsicherheit zu quantifizieren. Ihr Instrument führt eine Reihe von Mehrfachmessungen desselben Partikels durch, dessen Position und Geschwindigkeit genau kontrolliert werden, während es sich im Kanal bewegt, wodurch sie messungsabhängige Abweichungen von nur 1 % beobachten können.

„Dies ist das erste Mal, dass wir die Unsicherheit pro Objekt in einem Durchflusszytometer direkt messen können“, sagte Matthew DiSalvo, Hauptautor des NIST-Teams, das seine Ergebnisse am 20. Juli 2022 in der Zeitschrift veröffentlichte Labor auf einem Chip. „Wenn Sie etwas einmal und nur einmal messen, können Sie die Genauigkeit nicht überprüfen“, sagte er. „Dazu braucht man Wiederholbarkeit.“

Das neue serielle Durchflusszytometer im Chipmaßstab geht dieses Problem an, indem es vier Messungen jedes Partikels durchführt: zwei Messungen an jedem von zwei verschiedenen Punkten, die 16 Millimeter voneinander entfernt sind; (ca. 0,6 Zoll) im Kanal mit Strömungsraten von bis zu 100 oder mehr Partikeln pro Sekunde.

Mehrere kritische Herausforderungen mussten überwunden werden, um das neue Zytometer zu entwickeln, das zunächst mit einheitlichen Kunststoffkügelchen mit einem Durchmesser von etwa 15 Mikrometern (µm, Millionstel Meter), etwa einem Zehntel der Breite eines menschlichen Haares und der gleichen Größe wie getestet wurde durchschnittliche weiße Blutkörperchen.

Eine Herausforderung bestand darin, einen Kanal (ca. 40 µm x 80 µm) herzustellen, der zwei identische Zonen enthielt, in denen Laserlicht auf das vorbeilaufende Teilchen gerichtet wurde, und sicherzustellen, dass die größte Menge des emittierten Fluoreszenzlichts von einem Detektorpaar erfasst wurde, das gemessen wurde sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts. Zu diesem Zweck entwickelten DiSalvo und Projektleiter Gregory Cooksey fortschrittliche Wellenleiter, die Verluste minimierten und verhinderten, dass sich das Emissionslicht ausbreitete. Cooksey verfügt über umfangreiche Erfahrung mit bahnbrechenden Designs für die Mikrofluidik, und das Zytometerteam stützte sich auf diese Arbeit.

Eine weitere besonders anspruchsvolle Herausforderung bestand darin, einen Weg zu finden, um sicherzustellen, dass die in jeder der beiden Zonen im Kanal aufgezeichneten Emissionen von demselben Partikel stammten. Dies war nur möglich, indem die Position und Geschwindigkeit des Teilchens so genau gesteuert wurden, dass die Transitzeit von einem Knoten zum anderen genau bekannt war, sodass das System die Messungen am ersten Knoten mit denen am zweiten abgleichen konnte.

Dazu entwickelten die Forscher eine „Hybrid“-Technik, um das Teilchen auf eine bestimmte Stelle im Kanal zu fokussieren. Bei herkömmlichen Zytometern wird dies normalerweise durch die Verwendung von zwei unterschiedlichen Flüssigkeitspumpen erreicht: Eine zum Injizieren der Partikel und eine zum Erzeugen einer separaten Flüssigkeitshülle um den Innenumfang des Kanals herum, wodurch tatsächlich ein Flüssigkeitsschlauch innerhalb des festen Kanals gebildet wird. Dadurch wird die Probe im mittleren Kern des Kanals eingeschlossen.

Oder zumindest ist das die Vermutung. Aber tatsächlich, sagte Cooksey, in kleinen Kanälen „ist das der denkbar schlechteste Ort, an dem man es platzieren könnte“.

Der Grund dafür ist, dass die Trägheit der Flüssigkeit in kleinen Kanälen zwei Kräfte auf das Partikel ausübt. Eine Kraft wirkt, um das Teilchen von der Wand wegzuheben. Aber eine andere Kraft drückt das Teilchen von der Mitte des Kanals weg wegen der unterschiedlichen Fluidgeschwindigkeit, die auf beiden Seiten des Teilchens wirkt. Als Ergebnis neigt das Teilchen natürlich dazu, sich außermittig in eine Gleichgewichtsposition zu bewegen, in der die Kräfte ausgeglichen sind. Bei dem in dieser Studie verwendeten spezifischen Design variiert die Verschiebung von der Mittellinie mit der Geschwindigkeit des Fluids von etwa 11 µm bei 0,75 Metern pro Sekunde bis 14 µm bei 1,35 m/s.

Um diese Position sehr genau zu steuern, verwendeten DiSalvo und Cooksey vier Pumpen, um die Hülle anzutreiben, wodurch sie den Druck von einer Seite zur anderen sowie nach oben und unten anpassen konnten. „Wir verwenden die Hydrodynamik, um das Teilchen zu Beginn seines Transits an die Position zu bringen, von der wir wissen, dass es dorthin gehen möchte“, sagte DiSalvo. „Wenn also ein Partikel durch den Kanal beschleunigt wird, befindet es sich bereits in seiner Gleichgewichtsposition. Diese wird über die gesamte Länge des Zytometers sehr genau beibehalten.“

Dadurch ist das Gerät in der Lage, hochpräzise Messungen bei sich bewegenden Partikeln mit einer hohen Durchlaufgeschwindigkeit von 1 m/s durchzuführen. (1 m/s oder etwa 2,3 mph mag langsam erscheinen. Aber bei dieser Geschwindigkeit bewegt sich ein 10-µm-Partikel 100.000-mal seiner Körperlänge pro Sekunde. Ein Auto, das das tut, würde etwa 1 Million mph fahren.)

Seit die Experimente in dem neuen Zeitschriftenartikel berichtet wurden, misst das Team weiße Blutkörperchen in dem Gerät. „Das erste, was wir uns angesehen haben, ist, wo sich die Zelle in ihrem Teilungszyklus befindet“, sagte Cooksey. „Wir beobachten, wie viel DNA sich in der Zelle befindet. Das Fluoreszenzsignal lässt uns quantifizieren, wie viele der Zellen sich aktiv teilen und DNA-Synthesen durchlaufen.“

Die Forscher verwenden auch unterschiedliche Laserwellenlängen, um unterschiedliche Eigenschaften der Probe aufzudecken.

„Wir haben die Wellenleiter umfassend modifiziert, um die Empfindlichkeit durch den Einbau von Mikrolinsen und anderen Verbesserungen zu erhöhen“, sagte DiSalvo. „Wir glauben, dass wir bald Unsicherheitsmessungen bereitstellen und gleichzeitig die Empfindlichkeit kommerzieller Einzelmesssysteme erreichen können, die Hunderttausende von Dollar kosten.“

Das Cytometer-Projekt umfasst Mitarbeiter mit Fachwissen in Mathematik und Modellierung, was zu zusätzlichen neuen Analysemethoden führt, die die Quantifizierung und Klassifizierung verbessern werden. Die NIST-Forscher Paul Patrone und Anthony Kearsley haben die Signalanalyse verwendet, um Messabweichungen aufgrund von Strömungsschwankungen und Partikelgröße herauszufiltern. Ihre Methoden ermöglichen auch eine beispiellose Fähigkeit, Objekte zu identifizieren und zu trennen, die zuvor zu nahe beieinander lagen, um sie bei einer herkömmlichen Messung zu unterscheiden. Die Unfähigkeit, separate Objekte zu unterscheiden, verhindert die Genauigkeit beim Zählen und könnte dazu führen, dass eindeutige Probenkomponenten fehlen, wie z. B. zirkulierende Tumorzellen oder interagierende Immunzellen.