Die Genomeditierung gilt als einer der bahnbrechendsten wissenschaftlichen Durchbrüche unserer Zeit. Sie ermöglicht es uns, in den Code des Lebens einzutauchen und präzise Änderungen vorzunehmen. Stellen Sie sich vor, Sie könnten die genetischen Anweisungen neu schreiben, die fast alles über einen Organismus bestimmen – sein Aussehen, sein Verhalten, seine Interaktion mit seiner Umwelt und seine einzigartigen Merkmale. Das ist die Macht der Genomeditierung.
Wir verwenden Tools zur Genombearbeitung, um die genetischen Sequenzen von Mikroben, Tieren und Pflanzen zu optimieren. Unser Ziel? Erwünschte Merkmale zu entwickeln und unerwünschte zu eliminieren. Die Auswirkungen dieser Technologie sind in der Biotechnologie, der Humantherapie und der Landwirtschaft spürbar und bringen rasche Fortschritte und Lösungen.
Die am häufigsten verwendeten Proteine bei der Genomeditierung sind Cas9 und Cas12a. Diese Proteine sind wie die Scheren der genetischen Welt und ermöglichen es uns, DNA zu schneiden und zu bearbeiten. Sie sind jedoch recht sperrig und bestehen aus 1.000–1.350 Aminosäuren. Fortgeschrittene Editiertechnologien wie Base Editing und Prime Editing erfordern die Fusion zusätzlicher Proteine mit Cas9 und Cas12a, wodurch sie noch sperriger werden. Diese Sperrigkeit stellt eine Herausforderung dar, diese Proteine effizient in Zellen zu transportieren, in denen sich das genetische Material befindet.
Doch jetzt gibt es eine spannende Entwicklung – eine Miniatur-Alternative, die diese Einschränkung zu überwinden verspricht. Aktueller Artikel im Zeitschrift für Pflanzenbiotechnologiehaben wir TnpB eingeführt, ein kleineres, aber äußerst effektives Werkzeug der nächsten Generation zur Genombearbeitung bei Pflanzen.
TnpBs sind winzige Vorfahren der Cas12-Nuklease
TnpB-Proteine sind transposonassoziierte Nukleasen, die von RNA gesteuert werden. Sie gelten als die evolutionären Vorfahren der Cas12-Nukleasen. Obwohl TnpB funktionell Cas12a ähnelt, ist es mit einer Gesamtaminosäurezahl von 350–500 viel kompakter. Zum Vergleich: TnpB ist ein Drittel so groß wie Cas9 und Cas12a. Wenn Cas9 und Cas12a wie Fußbälle sind, sind TnpBs wie Baseballs.
Wir haben einen hyperkompakten Genom-Editor entwickelt, der die TnpB-Nuklease von Deinococcus radiodurans verwendet. Dieses Bakterium ist für seine Fähigkeit bekannt, in extremen Umgebungen zu überleben und seine bemerkenswerte Strahlungsresistenz. Unser TnpB aus D. radiodurans ist nur 408 Aminosäuren lang.
Eine kurze RNA dient TnpB als Leitfaden und führt es zur Ziel-DNA-Sequenz. Von dieser RNA spezifiziert bindet sich TnpB an das Ziel und spaltet beide DNA-Stränge. Wenn die gebrochenen Enden von der Zelle wieder verschlossen werden, kann es unbeabsichtigt zu Einfügungen oder Löschungen von DNA-Buchstaben kommen. Diese Einfügungen oder Löschungen führen zur Veränderung genetischer Sequenzen.
Es gibt noch eine weitere Spezifitätsebene: Die Zielsequenz muss neben einer Transposon Associated Motif (TAM)-Sequenz liegen. Dieses TAM ist analog zur PAM-Sequenz von Cas9 und Cas12. Für das TnpB von D. radiodurans ist das spezifische TAM TTGAT, das vor der Zielsequenz vorhanden sein muss. In diesem Sinne kann TnpB auf genomische Loci zugreifen, die Cas9 nicht erreichen kann.
Neuverwendung von TnpB zur Bearbeitung des Pflanzengenoms
Wir haben zunächst die Sequenz des TnpB-Proteins codon-optimiert, um einen Genom-Editor für Pflanzensysteme zu entwickeln. Außerdem haben wir die Kombinationen der regulatorischen Elemente optimiert, um genügend Leit-RNA für eine hocheffiziente Genom-Editierung von Pflanzen zu produzieren. Durch das Testen von vier verschiedenen Versionen von Genom-Editierungs-Vektorsystemen in Reisprotoplasten haben wir die effektivste Version identifiziert.
Reis ist eine Monokotyle, und Systeme, die bei Monokotylen gut funktionieren, funktionieren bei Dikotylen möglicherweise nicht so gut. Daher haben wir Dikotylen-spezifische TnpB-Vektoren erzeugt und eine erfolgreiche Bearbeitung bei Arabidopsis demonstriert. Interessanterweise haben wir beobachtet, dass die meisten Deletionen sowohl bei Reis als auch bei Arabidopsis an den Zielloci auftraten. Dies macht TnpB geeignet, Genfunktionen effektiv zu stören. TnpB könnte nun verwendet werden, um genetische Mutationen einzuführen, um unerwünschte Gene zu stören, um Antinährstofffaktoren zu entfernen, den Nährstoffgehalt, die biotische und abiotische Stressresistenz und mehr zu verbessern.
Ein toter TnpB für die Genaktivierung und den Austausch einzelner DNA-Buchstaben
Während TnpB in seiner nativen Form als programmierbare Schere fungiert, kann es auch angepasst werden, um Faktoren zu rekrutieren, die Gene aktivieren. Durch Inaktivierung seiner Schneidefähigkeit haben wir deaktiviertes TnpB (dTnpB) entwickelt. dTnpB behält seine Fähigkeit, an Ziel-DNA zu binden, die durch Leit-RNA spezifiziert wird. Anschließend haben wir dTnpB mit zusätzlichen Frachtproteinen fusioniert, um sie zu Zielgenen zu leiten und diese Gene aktiver zu machen. Dieses Aktivierungswerkzeug kann die Genfunktion steigern und so den Weg für die Schaffung besserer Nutzpflanzen in der Zukunft ebnen.
In ähnlicher Weise haben wir ein weiteres Frachtprotein mit dTnpB fusioniert, um ein Werkzeug zu entwickeln, das einen DNA-Buchstaben gegen einen anderen austauschen kann. Dieses präzise Werkzeug wird Innovationen bei Nutzpflanzen ermöglichen, indem es den genetischen Code mit Einzelbuchstabenauflösung verändert.
Wir nutzen diesen Miniatur-Genomeditor, um Reispflanzen mit verbesserten Erträgen und erhöhter Klimaresistenz zu züchten. Unsere Forschung hebt TnpB als äußerst vielseitiges und vielversprechendes Werkzeug für die Genomtechnik von Pflanzen hervor. Wir gehen davon aus, dass Pflanzenbiologen, Biotechnologen und Züchter TnpB für den Einsatz in einer Vielzahl von Nutzpflanzen einsetzen werden.
Diese Geschichte ist Teil von Science X Dialogwo Forscher Ergebnisse aus ihren veröffentlichten Forschungsartikeln melden können. Besuchen Sie diese Seite für Informationen zum Science X Dialog und zur Teilnahme.
Mehr Informationen:
Subhasis Karmakar et al., Eine Miniaturalternative zu Cas9 und Cas12: Transposon-assoziiertes TnpB vermittelt gezielte Genom-Editierung in Pflanzen, Zeitschrift für Pflanzenbiotechnologie (2024). DOI: 10.1111/pbi.14416
Dr. Kutubuddin Molla ist Wissenschaftler und spezialisiert sich auf Agrarbiotechnologie am ICAR-National Rice Research Institute (NRRI) in Cuttack, Indien. Er erhielt seinen Ph.D. von der Universität Kalkutta in Kolkata. Dr. Molla hat mit einem Fulbright-Stipendium an der Pennsylvania State University geforscht.
Dr. Mollas Forschungsinteressen konzentrieren sich auf die präzise Genombearbeitung unter Einsatz von CRISPR-Cas und anderen fortschrittlichen Techniken zur Verbesserung von Nutzpflanzen. Sein Labor am NRRI widmet sich der Entwicklung neuartiger Genombearbeitungswerkzeuge und deren Anwendung zur Verbesserung der Nutzpflanzenleistung.