Beschreibung der dynamischen transkriptionellen und epigenetischen Landschaft, die die Hämatopoese reguliert

Ein Forschungsteam unter der Leitung von Professor Megumu K. Saito (Abteilung für klinische Anwendung) untersuchte die dynamische Transkriptions- und epigenetische Landschaft während der definitiven Hämatopoese und enthüllte die nicht-redundanten Rollen von ZEB2 und MEIS1, die für die Produktion hämatopoetischer Stammzellen aus dem hämogenen Endothel von entscheidender Bedeutung sind. Die Studie ist veröffentlicht im Tagebuch iScience.

Die Zelldifferenzierung, der Prozess, durch den Zellen zelluläre Identität und einzigartige funktionelle Eigenschaften erlangen, wird hauptsächlich durch zelltypspezifische Verstärker gesteuert, die durch Umwelteinflüsse oder bereits vorhandene Regulatoren aus einem früheren Entwicklungsstadium aktiviert werden.

Für viele Zelltypen, wie etwa hämatopoetische Vorläuferzellen (HPCs), gibt es jedoch keinen einzigen Hauptregulator, der die Differenzierung steuert. Daher müssen mehrere Faktoren eng zusammenarbeiten, um schrittweise zelltypspezifische Differenzierungsprogramme sorgfältig zu fördern. Der genaue Zeitpunkt und die Reihenfolge der Enhancer-Aktivierung sind von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, dass die Zellen dem Differenzierungsverlauf ordnungsgemäß folgen. Viele Details bleiben jedoch ein Rätsel.

Mithilfe eines aus menschlichen embryonalen Stammzellen (ESC) abgeleiteten Differenzierungssystems für hämatopoetische Zellen, das Saito und sein Forscherteam zuvor beschrieben haben, sammelten sie ESCs, Endothelzellen (ein Zwischenstadium zwischen ESCs und HPCs im Differenzierungsverlauf) und HPCs zu verschiedenen Zeitpunkten während der Differenzierung, um ihre Transkriptome und Enhancer-Signaturen durch RNA-Sequenzierung (RNA-seq) bzw. Acetyl-Histon-Chromatin-Immunpräzipitation und -sequenzierung (H3K27ac ChIP-seq) zu profilieren.

RNA-seq rekapitulierte den schrittweisen Transkriptom-Umbau der Zellen von einem ESC-ähnlichen Zustand in einen HPC-ähnlichen Zustand, angereichert mit Genen, die an der lymphoiden und myeloischen Differenzierung beteiligt sind, und validierte so das Differenzierungssystem. Umgekehrt gruppierten sich aktivierte Enhancer in drei Gruppen, abhängig vom Zeitpunkt der Aktivierung (Gruppe 1, ausschließlich HPCs; Gruppe 2, aktiviert in Endothelzellen im Spätstadium vor der HPC-Differenzierung; und Gruppe 3, hauptsächlich in Endothelzellen aktiv, aber in HPCs herunterreguliert). .

Bestätigt durch aktuelle Erkenntnisse über mehrere Schlüsselgene, die an der Differenzierung hämatopoetischer Zellen beteiligt sind, deuten diese Daten darauf hin, dass die Enhancer-Aktivierung vor der Spezifikation der hämatopoetischen Abstammungslinie erfolgt und die charakteristische Genexpression steuert.

Durch die Untersuchung der Transkriptionsfaktor-Bindungsmotive in den aktivierten Enhancern jedes Clusters kamen die Forscher zu dem Schluss, dass dies eine perfekte Gelegenheit darstellt, Faktoren zu identifizieren, die an der Aktivierung hämatopoetischer Enhancer beteiligt sind. Sie konzentrierten sich insbesondere auf angereicherte Motive, die vor der HPC-Differenzierung aktiviert wurden und sich in der Nähe von Genen befinden, die mit der Differenzierung hämatopoetischer Zellen zusammenhängen, und identifizierten ZEB2-Bindungsmotive, die mit Cluster-1- und -2-Enhancern angereichert werden sollen.

Darüber hinaus wurde die ZEB2-Expression in den Endothelzell- und HPC-Differenzierungsstadien nachgewiesen, was genau der Übergangsperiode entsprach, in der sie erforderlich wäre. Um die Rolle von ZEB2 bei der Regulierung der Hämatopoese zu testen, löschten die Forscher ZEB2 in ESCs und induzierten pluripotente Stammzellen (iPSCs) mithilfe des CRISPR/Cas9-Genomeditierungssystems und stellten fest, dass weder (ZEB2-Knockout-(KO)-ESCs noch iPSCs) hämatopoetische Zellen produzieren konnten , was darauf hindeutet, dass ZEB2 für die HPC-Entwicklung von wesentlicher Bedeutung ist.

Bemerkenswert ist, dass bei der Untersuchung ihres globalen Genexpressionsmusters die ZEB2-KO-Zellen am Tag 10 der HPC-Differenzierung den Endothelzellen am Tag sieben ähnelten, was darauf hindeutet, dass die Progression zu HPC gestoppt wurde. Darüber hinaus stellte das Forschungsteam über H3K27ac ChIP-seq einen massiven Rückgang der aktivierten Enhancer in ZEB2-KO-Zellen fest, was die Rolle von ZEB2 bei der Schaffung einer idealen epigenetischen Landschaft für die Differenzierung von Endothelzellen in HPCs während der Entwicklung untermauert.

Darüber hinaus trennten die Forscher die Cluster-2-Enhancer weiter, um sich speziell auf diejenigen mit verminderter Aktivität in Abwesenheit von ZEB2 zu konzentrieren und ZEB2-abhängige Faktoren zu identifizieren, die möglicherweise auch für die HPC-Differenzierung von entscheidender Bedeutung sind. Durch diese Bemühungen identifizierten sie MEIS1-Bindungsmotive, die an Enhancern angereichert werden sollen, die von der ZEB2-Deletion betroffen sind, und stellten fest, dass es sich um ein Zielgen von ZEB2 handelt.

Um die Beziehung zwischen ZEB2 und MEIS1 bei der Regulierung der Hämatopoese besser zu verstehen, löschte das Forschungsteam MEIS1 separat und stellte fest, dass die HPC-Differenzierung erheblich gestört war. Ähnlich wie bei ZEB2-KO-Zellen ergab die Transkriptomanalyse, dass MEIS1-KO-Zellen nicht in der Lage sind, das hämatopoetische Transkriptionsprogramm zu aktivieren. Dennoch differenzierten einige MEIS1-KO-Zellen zu HPCs, wenn auch mit viel geringerer Effizienz, und ihr globales Genexpressionsmuster zeigte ein Wildtyp-ähnliches Transkriptomprofil.

Durch die Löschung von ZEB2 und MEIS1 stellten die Forscher fest, dass ZEB2/MEIS1-Doppel-KO-Zellen eine stärkere Beeinträchtigung der HPC-Differenzierung aufweisen, was auf eine teilweise redundante Rolle dieser beiden Proteine ​​bei der Aktivierung des hämatopoetischen Transkriptionsprogramms schließen lässt. Allerdings konnte nur die ZEB2-Reexpression teilweise Defekte bei der Aktivierung des hämatopoetischen Enhancers beheben, da die MEIS1-Aktivierung nicht das gleiche Ergebnis erzielte, was den unterschiedlichen Bedarf für ZEB2 und MEIS2 verdeutlicht.

Durch diese Studie identifizierten Saito und sein Forschungsteam die unabhängigen Beiträge von ZEB2 und MEIS1 zur Hämatopoese. Dabei klärten sie die Rolle von ZEB2 auf, einem Regulator, der weithin in Endothelzellen exprimiert wird und entscheidend dafür ist, Endothelzellen entlang des Entwicklungspfads in Richtung HPCs voranzutreiben. Wie ZEB2 und MEIS1 die Aktivierung hämatopoetischer Enhancer regulieren, wird für die Verbesserung der Ex-vivo-HPC-Erzeugung aus iPSCs für Zwecke der regenerativen Medizin und der Arzneimittelforschung von entscheidender Bedeutung sein.