CTCF ist ein wichtiges Protein, von dem bekannt ist, dass es verschiedene Rollen in wichtigen biologischen Prozessen wie der Transkription spielt. Wissenschaftler des St. Jude Children’s Research Hospital haben eine Proteinabbautechnologie der nächsten Generation verwendet, um CTCF zu untersuchen. Ihre Arbeit zeigte die Überlegenheit des Ansatzes und lieferte funktionelle Einblicke in die Regulierung der Transkription durch CTCF. Die heute veröffentlichte Studie in Genombiologieebnet den Weg für klarere, nuanciertere Studien von CTCF.
Die Transkription ist ein wesentlicher biologischer Prozess, bei dem DNA in RNA kopiert wird. Der Prozess ist der erste erforderliche Schritt in einer Zelle, um die in der DNA enthaltenen Anweisungen zu übernehmen und diesen Code schließlich in die Aminosäure- oder Polypeptidbausteine zu übersetzen, die zu aktiven Proteinen werden. Eine fehlregulierte Transkription spielt bei vielen Arten von pädiatrischem Krebs eine Rolle. Wege zu finden, Aspekte der Transkriptionsmaschinerie zu modifizieren oder gezielt darauf abzuzielen, ist eine neue Grenze bei der Suche nach Schwachstellen, die therapeutisch ausgenutzt werden können.
Während die Biologie von CTCF ausführlich untersucht wurde, bleibt die Funktion der verschiedenen Domänen (Teile) von CTCF in Bezug auf die Transkriptionsregulation unklar.
Eine der wertvollsten Möglichkeiten, ein Protein zu untersuchen, besteht darin, es aus einem Modellsystem abzubauen (zu entfernen). In Abwesenheit des Proteins können Forscher die auftretenden funktionellen Veränderungen untersuchen und Einblicke gewinnen, wie das Protein eine Zelle beeinflusst. Ein System zum Abbau von Proteinen ist das Auxin-induzierbare Degron 1 (AID1)-System. Dieses System schränkt jedoch die genaue Untersuchung der Funktion von CTCF ein, wie z. B. die hohe Dosierungsabhängigkeit von Auxin, die eine zelluläre Toxizität verursacht, die die Ergebnisse durcheinander bringt.
Wissenschaftler in St. Jude wandten das System der zweiten Generation, Auxin-induzierbares Degron 2 (AID2), auf CTCF an (das System wurde von Masato Kanemaki, Ph.D., am National Institute of Genetics entwickelt). Dieses System eignet sich hervorragend für Funktionsverluststudien, überwindet die Einschränkungen des AID1-Systems und eliminiert die Off-Target-Effekte, die bei früheren Ansätzen beobachtet wurden.
„Wir haben das Verständnis der Auswirkungen von CTCF mithilfe eines Abbaumodells, des AID2-Systems, aufgebrochen“, sagte Co-Autor Chunliang Li, Ph.D., St. Jude Department of Tumor Cell Biology. „Mit diesem System haben wir die Regeln identifiziert, die die CTCF-abhängige Transkriptionsregulation regeln.“
„Wenn das CTCF-Protein weg ist, haben wir und andere beobachtet, dass sich nur sehr wenige Gene transkriptionell verändern“, sagte Li. „Wir wissen, dass die Auswirkungen auf die Transkription minimal sind, wenn wir den größten Teil des CTCF-Proteins in Zellen entfernen. Die Trennung zwischen dem Proteinabbau und der Transkription muss also einem Mechanismus folgen. Wir haben einen Teil des Mechanismus identifiziert. Das Protein ist nicht nur darauf angewiesen auf die Bindung an die DNA durch die Erkennung des CTCF-DNA-Bindungsmotivs, sondern stützt sich auch auf bestimmte Domänen, um an spezifische Sequenzen zu binden, die das Motiv flankieren. Bei einer Untergruppe von Genen wird die Transkription nur reguliert, wenn CTCF an diese spezifischen Sequenzen bindet.
„Austauschsystem“ beleuchtet die Rolle von Zinkfingerdomänen
Die Forscher kombinierten das AID2-System mit Spitzentechniken wie SLAM-seq und sgRNA-Screening, um zu untersuchen, wie der Abbau von CTCF die Transkription verändert.
„Mit der Degradation können wir einen sehr sauberen Hintergrund schaffen und dann eine Mutante einführen. Dieser Wechsel geschieht sehr schnell, deshalb nennen wir es ein schnelles Austauschsystem“, sagte Li. „Dies ist das erste Mal, dass ein sauberes und schnelles Austauschsystem verwendet wurde, um einzelne Mutanten von CTCF zu untersuchen.“
Durch ihre Arbeit identifizierten die Wissenschaftler die Zinkfinger(ZF)-Domäne als die Region innerhalb von CTCF mit der größten funktionellen Relevanz, einschließlich ZF1 und ZF10. Das Entfernen von ZF1 und ZF10 aus dem Modellsystem offenbarte genomische Regionen, die diese ZFs unabhängig voneinander benötigen, um DNA zu binden und die Transkription zu regulieren.
„CTCF selbst ist ein multifunktionales Protein“, sagte Co-Erstautorin Judith Hyle, St. Jude Department of Tumor Cell Biology. „Es hat verschiedene Rollen in einer Zelle, von der Aufrechterhaltung der Chromatinarchitektur bis zur Transkriptionsregulation, entweder als Aktivator oder Repressor der Transkription. Unser Interesse gilt der Frage, wie CTCF an der Transkriptionsregulation beteiligt ist, und mit diesem neuen System konnten wir CTCF viel schneller abbauen Wir konnten diesen peripheren Zinkfingern einige Funktionen zuweisen, die noch nicht gut verstanden wurden, was zeigt, dass bestimmte Regionen innerhalb des Genoms diese Zinkfingerbindungen für die Transkriptionsregulation erforderten oder von ihnen abhängig waren. Das war das erste Mal, dass es in einem zellularen System gesehen oder bestätigt wurde.“
Eine offene Tür für weitere Forschung
Das überlegene System ermöglichte es den Forschern, Mutationen einzuführen, die durch ihr Modell verfolgt werden konnten. Die Wissenschaftler führten dann funktionelle Studien durch, um die Folgen solcher Mutationen in Bezug auf die CTCF-Bindung und Transkriptionsregulation zu verstehen.
Über den neuen Ansatz sagte Co-Erstautor Mohamed Nadhir Djekidel, Ph.D., St. Jude Center for Applied Bioinformatics: „Da man saubere Daten über die Mutanten erhalten kann, wenn endogenes Protein abgebaut wird, kann man tatsächlich darauf schließen genregulatorisches Netzwerk, und das öffnet die Tür für verschiedene nachgelagerte Analysen, um zu verstehen, wie die Regulierung funktioniert.“
Die Studie demonstriert die Überlegenheit des AID2-Systems für den Abbau von Proteinen und zeigt die Bedeutung der Untersuchung von CTCF in einem klaren System. Dies ist eine wichtige Bestätigung für andere Forscher auf dem Gebiet der Transkriptionsregulationsforschung. Die Arbeit hat auch neue Wege für die Erforschung dieses Schlüsselproteins aufgezeigt.
Mitautor der Studie ist Beisi Xu, Ph.D., St. Jude Center for Applied Bioinformatics. Weitere Autoren sind Justin Williams, Shaela Wright und Ying Shao von St. Jude.
Mehr Informationen:
Judith Hyleet al., Genombiologie (2023).