Tests an lebenden Zellkulturen werden für die personalisierte Medizin, die Arzneimittelentwicklung und die klinische Forschung immer wichtiger. Die Aachener Fraunhofer-Institute für Lasertechnik ILT und für Produktionstechnik IPT haben ein KI-gestütztes Hochdurchsatzverfahren entwickelt, das nun die automatische Isolierung bestimmter Zelltypen ermöglicht.
Mit einem sogenannten LIFTOSCOPE können Labore pro Sekunde Dutzende lebende Zellen lokalisieren, identifizieren und analysieren, um sie mit laserinduziertem Vorwärtstransfer (LIFT) auf Mikrotiterplatten zu übertragen. Bei analytica 2024 Vom 9. bis 12. April 2024 in München stellt die Fraunhofer-Gesellschaft das innovative Verfahren in Halle A3, Stand 407 erstmals der Öffentlichkeit vor.
Pluripotente Stammzellen sind der Schlüssel zur personalisierten Medizin. Sobald sie aus Blut- und Gewebeproben isoliert wurden, können sie zur Züchtung von Zelltypen unterschiedlicher Gewebe verwendet werden. Da diese kultivierten Zellkulturen die Durchführung individueller Drogen- und Unverträglichkeitstests außerhalb des Körpers ermöglichen, sind sie ein leistungsstarkes Hilfsmittel bei der Auswahl hochspezifischer, personalisierter Therapien. Um jedoch eine personalisierte Behandlung im klinischen Alltag zu etablieren, benötigt die Medizin effiziente Methoden zur Isolierung pluripotenter Stammzellen.
Darüber hinaus sucht die Pharmaforschung nach Methoden, um sogenannte High-Producer-Zellen aus polyklonalen Kulturen für die Medikamentenentwicklung abzutrennen und in monoklonale Kulturen zu überführen, ohne die Zellvitalität oder die Teilungsfähigkeit zu beeinträchtigen. Auch Kliniken mussten während der Pandemie erkennen, dass die verfügbaren Methoden zur Isolierung und Analyse von (Immun-)Zellen aus Patientenproben ihre Labore an ihre Kapazitätsgrenzen bringen.
Die Innovation der Forscher der Fraunhofer-Institute für Lasertechnik ILT und für Produktionstechnik IPT steigert die Effizienz deutlich, da sie Zellen vollautomatisch sortiert und isoliert. Das LIFTOSCOPE integriert einen KI-gestützten Hochdurchsatzprozess in ein handelsübliches inverses Mikroskop, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera und einer Blitzlichtquelle ausgestattet ist. Das LIFTOSCOPE vereint drei High-Tech-Verfahren in einem Gerät, um Zellen innerhalb von Mikrosekunden zu identifizieren und mit hohen Überlebensraten von über 90 % auf Mikrotiterplatten zu übertragen.
Mit KI und Lasern zur vollautomatischen Zellselektion
Das Projektteam hat das am Fraunhofer ILT entwickelte patentierte MIR-LIFT-Verfahren direkt in den Strahlengang des Mikroskops integriert. Ein daran angeschlossenes Kamerasystem liefert einhundert hochauflösende Bilder pro Sekunde. Die am Fraunhofer IPT entwickelte KI identifiziert mithilfe semantischer Segmentierung die gewünschten Zelltypen in diesen Bilddaten und kann darauf trainiert werden, pluripotente Stammzellen, Hochleistungszellen und Immunzellen zu erkennen.
Die KI bestimmt außerdem die genaue Position und den Schwerpunkt der Zellen. Im MIR-LIFT-Verfahren werden sie dann nacheinander mit einer Hochfrequenzrate von bis zu 100 Hz auf eine Mikrotiterplatte in einer am Fraunhofer ILT entwickelten Halterung übertragen. „Je nach Zelltyp überleben bis zu 100 % aller Zellen diesen Vorgang“, erklärt Dr. Nadine Nottrodt, Leiterin der Gruppe Biofabrikation, die gemeinsam mit Projektleiter Richard Lensing das gemeinsame Entwicklungsprojekt am Fraunhofer ILT betreut.
Der LIFT-Prozess selbst ist faszinierend einfach. Ein kurzer 9-Nanosekunden-Laserpuls mit einigen Mikrojoule Pulsenergie reicht aus, um das flüssige Medium direkt unter der Zielzelle zur Bildung einer Dampfblase anzuregen. Die zuvor enzymatisch aus ihrer Bindung gelöste Zelle wird durch die Blase kurzzeitig angehoben.
Sobald die Blase platzt, entsteht ein Sog, der die Zelle in das Kulturgefäß der Mikrotiterplatte spült. „Die Zellen sind in den Proben zufällig verteilt. Aus diesem Grund folgt unser System einem vordefinierten Raster und überträgt Zellen, die sich in einem Radius von 50 Mikrometern um den Fokuspunkt befinden“, erklärt Lensing. Dort kann das LIFTOSCOPE die Zellen im hochpräzisen, optisch überwachten Laserprozess präzise steuern und transferieren. Bei Bedarf kann das LIFT-Verfahren auch mit Fluoreszenzmarkern kombiniert werden, um bestimmte Zellen zu identifizieren. Allerdings funktioniert das Verfahren auch ohne Zusatzstoffe robust.
Dafür gibt es zwei Gründe: Erstens sorgt die präzise Lokalisierung durch die KI dafür, dass die Zellen tatsächlich vom Strahl erfasst und in die Mikrotiterplatten transportiert werden. Zweitens ist es dem Fraunhofer ILT durch die kontinuierliche Weiterentwicklung des LIFT-Verfahrens gelungen, die zunächst benötigten metallischen Absorber aus dem Prozess zu eliminieren.
Da bei dem Verfahren ein Laser im mittleren Infrarotbereich mit einer Wellenlänge von 2.940 Nanometern zum Einsatz kommt, wird das bereits im System befindliche Wasser nun direkt angeregt, während die Polymere der Probenträger diese Wellenlänge nicht oder kaum absorbieren.
Kontinuierliche Bewegung versus Stop-and-Go-Prozess
Ziel des Projektteams ist es, den vollautomatischen Zellerkennungs- und LIFT-Prozess im Hinblick auf einen hohen Durchsatz zu stabilisieren und die Prozesszeit zur Fertigstellung einer Mikrotiterplatte auf zehn Minuten zu begrenzen. Dies erfordert hochpräzise Aktoren sowohl für die Bildgebung als auch für die Positionierung des Laserfokus im Prozesszyklus.
Dadurch wird einerseits sichergestellt, dass das Verfahren die erforderliche Bildauflösung für die KI-gestützte Zelldetektion und -vermessung erreicht und andererseits der Laserfokus direkt unterhalb der Zelle auf 25 Mikrometer genau zugeordnet und positioniert wird. Ein einzelner Zelltransfer ist innerhalb von 200 Mikrosekunden abgeschlossen. Innerhalb von 100 Sekunden können mit dem LIFTOSCOPE 10.000 Zellen aktiviert und auf die Mikrotiterplatten übertragen werden.
Für den Transport der Zellkultur verfolgte das Fraunhofer-Team zwei unterschiedliche Strategien. „Im Stop-and-Go-Betrieb muss vor und nach dem Zell-LIFT eine kurze Ruhephase eingelegt werden, da jeder Stopp hydrodynamische Strömungen in der Probe auslöst, die sich erst beruhigen müssen, bevor die nächste Zelle transferiert werden kann“, berichtet Nottrodt.
Diese Strategie ermöglicht es ihnen, Proben mit vielen verschiedenen Zellen zu sortieren und so den Aufwand für die Probenvorbereitung zu reduzieren. Allerdings gehen die Pausen zu Lasten der Effizienz. Im kontinuierlichen Verfahren – dem zweiten Ansatz – scannt das LIFTOSCOPE die Probenträger in einem Raster von bis zu 1.600 Linien mit 50 Mikrometer Abstand, abhängig vom gesuchten Zelltyp, und überträgt jede Zelle, die in dieser kontinuierlichen Bewegung in den Fokus kommt.
Der durch diese Methode gewonnene Zeitvorteil nimmt zu, je mehr Zellen übertragen werden. Selbst bei 10.000 übertragenen Zellen ist der kontinuierliche Prozess mehr als doppelt so schnell und bei 100.000 Zellen bereits 20-mal schneller als der Stop-and-Go-Betrieb.
Das neuartige, KI- und Laser-basierte Verfahren weist den Weg zu einer vollautomatisierten und hocheffizienten Isolierung lebender Zellen. Der bisherige Projektfortschritt zeige laut Nottrodt, dass eine Synchronisierung des Zell-LIFT mit der Bildfrequenz der Hochgeschwindigkeitskamera – und damit eine Einzelzell-Sortierrate von 100 Zellen pro Sekunde – machbar sei.
Im nächsten Schritt gilt es, den prototypischen Prozess zur Marktreife zu entwickeln. „Interessierte sind herzlich eingeladen, den Gemeinschaftsstand der Fraunhofer-Gesellschaft in Halle A3/407 auf der analytica 2024 zu besuchen, um sich das LIFTOSCOPE näher anzusehen“, so Nottrodt und Lensing. Angesichts des Potenzials der personalisierten Medizin muss diese Technologie schnell Eingang in die medizinische, pharmazeutische und klinische Praxis finden.
Bereitgestellt vom Fraunhofer-Institut für Lasertechnik ILT