Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), allgemein bekannt als Lou-Gehrig-Krankheit und Stephen-Hawking-Krankheit, ist eine neurodegenerative Erkrankung, die zum allmählichen Verlust der Kontrolle über die Muskeln im Körper führt. Es ist derzeit unheilbar und die Ursache der Krankheit ist in über 90 % aller Fälle unbekannt – obwohl angenommen wird, dass sowohl genetische als auch umweltbedingte Faktoren eine Rolle spielen.
Die Forschungsgruppen von Dr. Akira Kitamura an der Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University, und Prof. Jerker Widengren am KTH Royal Institute of Technology, Schweden, haben eine neuartige Technik entwickelt, die in der Lage ist, eine charakteristische Struktur von RNA zu erkennen Echtzeit in lebenden Zellen. Die Technik, die auf fluoreszenzmikroskopischer Spektroskopie basiert, wurde in der Zeitschrift veröffentlicht Nukleinsäureforschung.
„Einer der genetischen Faktoren, von denen angenommen wird, dass sie an der Entwicklung von ALS beteiligt sind, ist eine spezifische RNA-Sequenz, die eine viersträngige Struktur bildet, die als G-Quadruplex bezeichnet wird“, erklärt Kitamura, Erstautor der Studie. „Normalerweise regulieren diese Strukturen die Expression von Genen. Allerdings führt eine Mutation auf Chromosom 9 beim Menschen zur Bildung von G-Quadruplexen, die bei neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich ALS, eine Rolle spielen könnten.“
Eine der größten Hürden beim Verständnis der genauen Rolle von G-Quadruplexen bei Krankheiten waren die Einschränkungen bei der Untersuchung ihrer Bildung und Lokalisierung in lebenden Zellen in Echtzeit. Den Gruppen Kitamura und Widengren gelang die Entwicklung einer einfachen, robusten und breit anwendbaren Technik, die bestehende Probleme löst.
Die Technik verfolgt einen Cyaninfarbstoff namens Alexa Fluor 647 (AF647). Wenn er mit RNA markiert ist, wird der Fluoreszenz-Blinkzustand des Farbstoffs mit der Bildung der RNA-G-Quadruplexe verändert. Die Gruppen analysierten die AF647-markierte RNA mit einer Mikroskopietechnik namens TRAST (TRAnsient STate)-Überwachung, um dieses Fluoreszenzblinken in Echtzeit zu erkennen.
„Visuell erscheinen die zeitaufgelösten Intensitätsänderungen der Fluoreszenz als Blinken“, beschreibt Kitamura die Technik. „Bei TRAST setzen wir Zellen einem bestimmten Muster sich ändernder Lichtintensitäten aus und messen die durchschnittliche Intensität der Fluoreszenz, die von dem RNA-gebundenen Farbstoff in den Zellen über bestimmte Zeitintervalle emittiert wird. Durch die Messung von Änderungen der Blinkeigenschaften können wir die Strukturen von unterscheiden RNA in der Zelle.“
Das Team kalibrierte sein Experiment unter Laborbedingungen und bestimmte genau, welches Fluoreszenzblinken RNA-G-Quadruplexen entsprach. Aus diesen Daten konnten sie mithilfe von TRAST die Position von RNA-G-Quadruplexen in lebenden Zellen bestimmen.
Diese Arbeit beweist, dass Cyaninfarbstoffe empfindliche Anzeigeparameter für die Faltungszustände von RNA-G-Quadruplexen in lebenden Zellen und sogar für einzelne Zellen liefern können. Dies wiederum eröffnet die Möglichkeit, die RNA-G-Quadruplexe bei Erkrankungen in Echtzeit auf intrazellulärer Ebene zu untersuchen. Es kann auch angewendet werden, um die Faltung und Fehlfaltung von Proteinen in Zellen zu untersuchen.
Mehr Informationen:
Akira Kitamura et al., Trans-cis isomerization kinetics of cyanine dyes berichtet über die Faltungszustände von exogenen RNA-G-Quadruplexen in lebenden Zellen, Nukleinsäureforschung (2023). DOI: 10.1093/nar/gkac1255