Analyse molekularer Prozesse in lebenden Zellen mit einer Ortsauflösung von unter 10 nm

Forscher der Universität Würzburg haben die „Photoswitching Fingerprint Analysis“ entwickelt – eine einzigartige Technologie, die es erstmals ermöglicht, molekulare Prozesse und die Regulation einzelner Proteine ​​in lebenden Zellen mit einer Ortsauflösung von unter 10 nm zu analysieren. Seine Anwendung reicht von der biologischen bis zur medizinischen Forschung und die Arbeit wurde in veröffentlicht Naturmethoden.

Die superauflösende Mikroskopie ermöglicht die Aufnahme von Fluoreszenzbildern von Zellen, Organellen und molekularen Komplexen mit bisher unerreichter räumlicher Auflösung. Diese Auflösung reicht jedoch nicht aus, um nur wenige Nanometer kleine Proteine ​​und deren Wechselwirkungen mit anderen Molekülen oder die Architektur von Proteinkomplexen aufzulösen. Es verhindert zum Beispiel die Untersuchung des molekularen Zusammenspiels von Neuronen bei Lern- und Gedächtnisprozessen.

Überwindung dynamischer Auflösungsgrenzen

Die von der Forschungsgruppe von Prof. Markus Sauer (Rudolf-Virchow-Zentrum und Biozentrum) und Dr. Gerti Beliu (Rudolf-Virchow-Zentrum) an der Universität Würzburg entwickelte neue photoschaltende Fingerabdruckanalyse ermöglicht die optische Abbildung dynamischer Wechselwirkungen mit anderen Molekülen in der Zelle . „Bisher gibt es keine Methode, die zuverlässig eine optische Strukturauflösung in Zellen im Sub-10-nm-Bereich ermöglicht. Durch die Aufklärung dieser der Barriere zugrunde liegenden Ursache ist es uns erstmals gelungen, in Kombination mit neuen direkten Markierungsmethoden eine zelluläre Auflösung von wenigen Nanometern. Dieser Fortschritt ermöglicht es, molekulare Funktionen und die Architektur wichtiger Bestandteile unserer Zellen aufzudecken“, berichtet Sauer.

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-Methoden wie dSTORM, entwickelt in der Gruppe von Prof. Markus Sauer, erlauben Auflösungen im Bereich von 10-20 nm. In Kombination mit strukturierten Beleuchtungsmethoden konnten für Farbstoffe Lokalisierungsgenauigkeiten von bis zu 1 nm erreicht werden. Leider ließ sich diese hohe Lokalisierungspräzision nicht in eine räumliche Auflösung von wenigen Nanometern in Zellen übersetzen.

Das Problem: Aktuelle Markierungsmethoden, zum Beispiel die Immunfärbung mit einem Antikörper, verursachen einen Abstandsfehler von mehr als 10 nm. Infolgedessen verhindert die Größe der Markierungsmoleküle eine Auflösung im Nanometerbereich. Die anderen Ursachen für die Auflösungsbarriere unter 10 nm waren bisher unbekannt. „In unserer Veröffentlichung haben wir nun erstmals gezeigt, dass die Photoschaltraten (Blinken) von Farbstoffen zwischen einem An- und Aus-Zustand bei Abständen unter 10 nm durch verschiedene Energieübertragungsprozesse zwischen Farbstoffen stark beeinflusst werden. Dadurch entsteht ein Cluster von An-Zuständen in den ersten Sekunden eines Experiments verbunden mit einem schnellen Photobleichen der Farbstoffe, was ihre individuelle Lokalisierung erschwert“, erklärt Sauer. „Die reduzierte Lokalisierungswahrscheinlichkeit der Farbstoffe führt also zu einer schlechteren Strukturauflösung, als man aufgrund der individuellen Lokalisierungspräzision erwarten würde. Das ist ähnlich wie bei einem Orchester, wenn alle Instrumente zu Beginn des Stücks gleichzeitig ihre Beiträge spielen, das geht nicht.“ die einzelnen Tonspuren heraussuchen.“

Die Fluoreszenzintensitätsspur

Der photoschaltende Fingerabdruck und die Fluoreszenzabklingzeit enthalten aber auch Informationen über die Anzahl der vorhandenen Farbstoffe und aufgrund der Abstandsabhängigkeit des Energietransfers auch Informationen über deren Abstände, ohne die einzelnen Farbstoffe optisch auflösen zu können. Durch den Einbau unnatürlicher Aminosäuren in multimere Membranrezeptoren durch genetische Codeerweiterung und anschließende bioorthogonale Klickmarkierung mit kleinen Fluoreszenzfarbstoffen konnten die Würzburger Forschungsgruppen nun im nächsten Schritt zeigen, wie eine spezifische ortsspezifische Markierung von Proteinen in Zellen erreicht werden kann Abstandsfehler bei Abständen unter 10 nm. „Durch die Analyse der photoschaltenden Fingerabdrücke von multimeren Rezeptoren in der Plasmamembran konnten wir somit erstmals Abstände zwischen Rezeptoruntereinheiten im Bereich von 5–7 nm in Zellen abschätzen und die Anzahl der markierten Untereinheiten bestimmen“, sagt Beliu.

Molekulare Kommunikation visualisieren und verstehen

Im nächsten Schritt will das Forschungsteam die photoschaltende Fingerabdruckanalyse optimieren und in Kombination mit der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie unter Verwendung von Musteranregungsschemata und DNA-PAINT für eine zuverlässige superauflösende Bildgebung in Zellen mit einer Auflösung von unter 10 nm verwenden. Dies soll neue Einblicke in die molekulare Organisation von Zellstrukturen, Organellen und Multiproteinkomplexen sowie die Strukturaufklärung von Proteinstrukturen mit optischen Methoden liefern.

Die neu entwickelte Methode bietet nicht nur einzigartige Einblicke in molekulare Mechanismen in der Infektions-, Lipid- und Krebsforschung: Das Photoswitching Fingerprinting hat auch das Potenzial, die Dynamik und Komplexität von Rezeptoren im Nervensystem realistischer darzustellen, die für die Signalübertragung an den Synapsen wichtig sind von Neuronen. Dieses Zusammenspiel der Neuronen bestimmt unsere täglichen Lern- und Gedächtnisprozesse. „Daher ist es grundlegend wichtig zu verstehen, wie dieses molekulare Orchester zusammensetzt und funktioniert“, beschreibt Beliu die Bedeutung dieser Forschungsergebnisse.