Engineering zirkulärer Ribonukleinsäuren (circRNAs) für eine verbesserte Proteinproduktion

Zirkuläre Ribonukleinsäuren (circRNAs) sind eine vielversprechende Plattform für Genexpressionsstudien als stabile und vorherrschende Ribonukleinsäure in eukaryotischen Zellen, die durch Rückspleißen entstehen. In einem neuen Bericht, der jetzt in veröffentlicht wurde Naturbiotechnologie, Robert Chen und ein Team interdisziplinärer Forscher an der Stanford University, Kalifornien, USA, entwickelten einen systematischen Ansatz zum schnellen Zusammenbauen und Testen von Merkmalen, die die Proteinproduktion auf der Grundlage synthetischer zirkulärer RNAs beeinflussen. Das Team maximierte die Translation der circRNA, indem es feine Elemente optimierte, um Designprinzipien umzusetzen, um die Ausbeute an zirkulärer RNA um das Hundertfache zu verbessern. Die Ergebnisse erleichterten eine erhöhte Translation der interessierenden RNA im Vergleich zu Boten-RNA (mRNA)-Spiegeln, um eine dauerhafte Translation in vivo bereitzustellen.

Zirkuläre RNA (circRNA) im Labor entwickeln

Therapeutika auf der Basis von Ribonukleinsäuren sind breit gefächert Boten-RNA (mRNA), kleine interferierende RNAs (siRNA) und microRNAs (miRNA) mit Expansion in die moderne Medizin, einschließlich kleiner Moleküle, Biologika und Zelltherapeutika. Beispielsweise können die in letzter Zeit populären mRNA-Impfstoffe im Labor entworfen und in einem schnellen Tempo entwickelt werden, um auf sich entwickelnde und zu reagieren dringende medizinische Krisen. Kodierende RNAs können in circRNAs zirkularisiert werden, um die Dauer der Proteintranslation zu verlängern, basierend auf kovalenten RNA-Molekülen schließe dich Kopf an Schwanz an. Bioingenieure haben auch die Synthese vorangetrieben von kreisförmigen langen Transkripten in circRNAs. Die grundlegenden Mechanismen der Initiierung der Translation zur Bildung von zirkulärer RNA oder Boten-RNA unterscheiden sich jedoch aufgrund des Fehlens von a 7-Methylguanylat (M7G)-Kappe auf den zirkulären RNAs. Aus diesem Grund müssen Forscher die Prinzipien der zirkulären RNA-Translation gründlich untersuchen, um bessere Therapien zu entwickeln und möglicherweise die Translationskapazitäten von mRNA zu übertreffen. Um diesen Aspekt zu untersuchen, entwickelte das Team eine modulare Hochdurchsatzplattform, um synthetische zirkuläre RNAs für eine optimierte Translation und verbesserte Proteinausbeute aufzubauen und zu testen.

Eine modulare circRNA-Montageplattform

Die Wissenschaftler entwickelten eine modulare Klonplattform, die aus einem Satz kompatibler Teile besteht Goldenes Tor und Klonen von Gibson um das Testen von circRNAs mit höherem Durchsatz zu ermöglichen. Mithilfe der Plattform bestimmten sie, wie bestimmte Aspekte des zirkulären RNA-Designs ihre Übersetzung beeinflussten. Beispielsweise hatte das Team zuvor gezeigt, wie durch zirkuläre RNA ausgelöste Immunantworten in vivo vermieden werden können Modifizieren der Moleküle mit m6A. Die Auswirkungen dieses Schritts auf die zirkuläre RNA-Translation müssen die Forscher jedoch noch verstehen. Um dies zu beheben, nutzten Chen und das Team ihre Klonplattform und integrierten m6A. Im Vergleich zu unmodifizierten circRNAs zeigten diejenigen, die 5 % m6A enthielten, nach Transfektion oder Elektroporation in vitro die gleiche Translation. Die Wissenschaftler haben daher experimentell den Einfluss der Modifikation auf die Stabilität der zirkulären RNA gemessen.

Aufdeckung der Dynamik von circRNA für starke Translationsergebnisse

Um die Prinzipien aufzudecken, die der circRNA-Vektortopologie zugrunde liegen und für eine starke Translation erforderlich sind, begannen die Forscher mit der Synthese von circRNAs, um Varianten mit Peptiden zu erzeugen, die durch den Prozess codiert werden. Basierend auf den Ergebnissen zeigte das Team, dass eine Erhöhung der Abstandshalterlänge für die Translation nicht vorteilhaft war. Als nächstes zeigten sie, wie die 5′- und 3′-untranslatierten Regionen die circRNA-Translation verbessern könnten. Die Forscher führten auch eine Reihe von Experimenten durch, um die circRNA-Optimierung zu untersuchen, und verglichen sie dann in einem einzigen Experiment. Sie zeigten, wie die Veränderungen die Expression von circRNA schrittweise erhöhten, ohne die RNA-Ausbeute oder die Effizienz der Zirkularisierung zu beeinträchtigen. Sie zeigten auch, wie sich die Kinetik der circRNA- und mRNA-Translation signifikant unterschied, wobei circRNA mehr als 24 Stunden brauchte, um ihre maximale Translationslänge zu erreichen, was die Translationsdauer von mRNA bei weitem übertraf. Anschließend kombinierten sie die Reihe von circRNA-Optimierungen, um ihre Expression in vivo zu testen. Um die RNAs zu liefern, formulierte das Team sie mit ladungsändernde freisetzbare Transporter (CARTs) oder kationische Moleküle, die die mRNA-Expression in Mausmodellen vermitteln. Die Ergebnisse zeigten, wie die manipulierten circRNAs in vivo mit ähnlichen Stärken wie modifizierte RNAs exprimiert werden konnten, wenn auch mit längerer Dauer.

Ausblick

Auf diese Weise zeigten Robert Chen und Kollegen, dass die RNA-Zirkularisierung ein großes Potenzial hat, RNA-basierte Medikamente zu transformieren, indem sie die Haltbarkeit von relativ hochflüchtigen Molekülen verlängert. Angesichts der grundlegenden Unterschiede zwischen den Mechanismen der circRNA- und mRNA-Translation wurde das vorhandene Wissen über die Maximierung der mRNA-Translation nicht unbedingt auf circRNAs übertragen. Um diese Studie zu erleichtern, erstellte das Team eine modulare circRNA-Klonierungsplattform, um zahlreiche Sequenzvariationen und Optimierungen mehrerer Parameter zu testen. Mithilfe der Plattform identifizierten sie mehrere Ansätze zur Verbesserung der Proteintranslation von circRNAs mit Anwendungen zur breit angelegten Konstruktion von RNAs, um in vitro mehr Protein als mRNAs zu produzieren und eine längere Haltbarkeit ihrer Translation in vivo und in vitro zu zeigen. Die Wissenschaftler sezierten systematisch die Elemente, die die circRNA-Translation regulieren, um dann die interessierenden Regionen für erhöhte circRNA-Proteinausbeuten für eine dauerhafte Proteinproduktion in vivo zu optimieren.

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