Forscher machen erstmals Kryo-EM-Bilder von Nitrogenase in Aktion

Bisher war es unmöglich, die hochauflösenden Bilder von Nitrogenase, dem einzigen Enzym, das Stickstoff während der katalytischen Wirkung zu Ammoniak reduzieren kann, aufzunehmen. Jetzt berichten Forscher der University of California San Diego zum ersten Mal über Schnappschüsse von Nitrogenase während der Katalyse mit nahezu atomarer Auflösung unter Verwendung von kryogener Elektronenmikroskopie (KryoEM). Die Ergebnisse wurden in der Zeitschrift veröffentlicht Wissenschaft.

Diese Arbeit wurde durch eine enge Partnerschaft zwischen den Gruppen von Professor Akif Tezcan und Assistant Professor Mark Herzik, beide in der Fakultät für Chemie und Biochemie der UC San Diego, durchgeführt. Während Tezcan Nitrogenase seit langem untersucht, stellte Herzik das KryoEM-Know-how zur Verfügung, das für die Durchführung der Forschung erforderlich ist.

„Dies ist ein sehr wichtiger Fortschritt in Bezug auf die biologische Stickstofffixierung sowie die Strukturbiologie im Allgemeinen“, sagte Tezcan. „Es ist äußerst aufregend, Bilder mit atomarer Auflösung eines so dynamischen und komplexen Enzyms wie Nitrogenase in Aktion zu erhalten. Es öffnet die Türen zum vollständigen Verständnis des Mechanismus dieses rätselhaften Enzyms, das Forscher seit Jahrzehnten beschäftigt.“

Das Verständnis der Bedeutung dieser KryoEM-Bilder erfordert das Verständnis der enormen globalen Bedeutung der Stickstofffixierung. Alle Organismen benötigen für die Biosynthese von Lebensbausteinen wie Proteinen und DNA „feste“ Stickstoffquellen. Die meisten lebenden Organismen besitzen jedoch kein Nitrogenase-Enzym und können atmosphärischen Stickstoff nicht in eine bioverarbeitbare Form umwandeln.

Bis zum Aufkommen des Haber-Bosch-Prozesses – dem industriellen Verfahren zur Umwandlung von atmosphärischem Stickstoff in Ammoniak – vor mehr als hundert Jahren war Nitrogenase im Wesentlichen die einzige Quelle für gebundenen Stickstoff in der Biosphäre. Industriell hergestelltes Ammoniak wird weitgehend für Düngemittel verwendet, und sein Aufkommen revolutionierte die landwirtschaftliche Praxis in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts. Das Haber-Bosch-Verfahren wurde oft als treibender Faktor für die Explosion der Weltbevölkerung im vergangenen Jahrhundert angeführt, da es „Luft in Brot verwandelt“ habe.

Das Haber-Bosch-Verfahren ist jedoch sehr energieintensiv und erfordert Temperaturen von über 400 °C und hohe Wasserstoffgasdrücke. Geschätzte 1-2 % der gesamten globalen Energieerzeugung werden durch das Haber-Bosch-Verfahren verbraucht. Das Verfahren wirft auch Umweltbedenken auf, darunter das Auswaschen von Nitraten in das Grundwasser und höhere Emissionen des Treibhausgases Lachgas.

Eine Schlüsselfrage, die die Forschung zur biologischen Stickstofffixierung vorantreibt, ist der Unterschied zwischen Nitrogenase und dem Haber-Bosch-Prozess. Wie katalysiert das Enzym die Stickstoffreduktion bei Umgebungstemperatur und -druck, während der industrielle Prozess solch extreme Bedingungen erfordert?

„Wenn wir den Mechanismus der Nitrogenase verstehen, können wir nicht nur herausfinden, warum die Natur sie zu einem so komplexen Enzym entwickelt hat, sondern wir könnten auch Konstruktionsprinzipien für die Ammoniakproduktion auf kostengünstigere und umweltfreundlichere Weise aufdecken“, sagte er Tezcan.

Obwohl viel über die Struktur der Nitrogenase bekannt ist, war bisher niemand in der Lage, Bilder des Enzyms mit atomarer Auflösung beim „Umdrehen“ oder im Prozess der Katalyse von atmosphärischem Stickstoff zu Ammoniak aufzunehmen, hauptsächlich aufgrund technologischer Einschränkungen.

Obwohl Wissenschaftler mithilfe der Röntgenkristallographie Bilder von Proteinen mit atomarer Auflösung erhalten können, erfordert diese Methode, dass die Proteine ​​in einem Kristall an Ort und Stelle fixiert werden – gewissermaßen stationär –, was bedeutet, dass sie keine Nitrogenase in Aktion erfassen kann. Die Nitrogenase-Katalyse erfordert, dass verschiedene Teile des Enzyms miteinander assoziieren und sich dann mehrmals trennen, um aus Stickstoff ein einziges Ammoniakmolekül herzustellen. Der Prozess ist alles andere als stationär.

CryoEM ermöglicht es Forschern nicht nur, die Strukturen von Proteinen zu erfassen, ohne dass sie in Kristallen fixiert werden müssen, sondern dank jüngster Fortschritte in der Hardware und Datenverarbeitung auch mit atomarer Auflösung. Eine solch hohe Auflösung ist erforderlich, um die kleinen Veränderungen im Zusammenhang mit der enzymatischen Katalyse sichtbar zu machen.

Diese Fortschritte veranlassten Tezcan und die Doktorandin Hannah Rutledge, die Verwendung von CryoEM zur Untersuchung der Nitrogenase in katalytischer Wirkung in Betracht zu ziehen. Und dafür suchten sie die Hilfe des ansässigen KryoEM-Experten Mark Herzik und seiner Gruppenmitglieder Brian Cook und Hoang Nguyen.

„Dies war sowohl während der Pandemie ein aufregendes als auch technologisch herausforderndes Projekt. Obwohl KryoEM eine sehr leistungsfähige Technik ist, haben nur wenige Studien über Enzyme berichtet, während sie einer Katalyse unterzogen werden. Die kritischen Erkenntnisse und technologischen Entwicklungen in dieser Studie ebnen nicht nur wegweisend für zukünftige Erforschungen des Nitrogenase-Mechanismus, sondern von Enzymen im Allgemeinen“, sagte Herzik.

Herzik und Rutledge arbeiteten eng zusammen, um Hunderte von KryoEM-Proben vorzubereiten. Da Nitrogenase sauerstoffempfindlich ist, wurden die Proben in einer anaeroben Glovebox vorbereitet, dann schnell transferiert und innerhalb von Sekunden eingefroren, um jeglichen Abbau zu verhindern. Am Ende sammelte das Team über 15.000 Videos, in denen über 20 Millionen einzelne Moleküle in verschiedenen Stadien der Katalyse aufgenommen wurden.

Die Teams brauchten fast ein Jahr, um mehrere Terabyte an Daten zu sortieren: Sie verwarfen Bilder von geringer Qualität, identifizierten und klassifizierten dann alle Partikel. Schließlich gelang es ihnen, mitten im Umsatz die ersten atomar aufgelösten Bilder der Nitrogenase zu erhalten.

Die CryoEM-Strukturen zeigten mehrere unerwartete Merkmale der Nitrogenase, die zuvor in Röntgenstrukturen nicht beobachtet wurden. Wichtig ist, dass die neuen Beobachtungen eine neue mechanistische Hypothese für die Nitrogenase-Katalyse liefern. Tezcan und Herzik hoffen, noch viele Jahre zusammenzuarbeiten, um diese Hypothesen zu testen und den katalytischen Mechanismus der Nitrogenase im Detail zu verstehen.

„Das ist erst der Anfang“, sagte Tezcan. „Wir haben jetzt ein Bild des gesamten Enzyms, nicht nur eines bestimmten Teils, während der katalytischen Wirkung. Dies wird wirklich die Schleusen für weitere Forschungen öffnen, um zu verstehen, wie Nitrogenase funktioniert, und möglicherweise später effizientere Prozesse zur Herstellung von Fixiermitteln zu entwickeln Stickstoff.“