Fluoreszenzmikroskopie zeigt, wie lebende Zellen Vesikel bilden, um Ladungen wie Wachstumsfaktoren zu transportieren

Zellen haben eine clevere Möglichkeit, Ladungen wie Wachstumsfaktoren durch die Zellmembran und in die Zelle zu transportieren. Sie wird Clathrin-vermittelte Endozytose genannt. Moleküle des Proteins Clathrin sammeln sich auf der Innenseite der Zellmembran und verformen die Membran, sodass von außen gesehen eine Grube entsteht.

Nachdem es sich mit Ladung gefüllt hat, schnürt sich die Grube ab und bildet ein Clathrin-beschichtetes, membrangebundenes Vesikel innerhalb der Zelle, das dann zu seinem eigentlichen Bestimmungsort weitergeht. In kultivierten Zellen können sich jede Minute Hunderte dieser Clathrin-beschichteten Vesikel bilden.

Es gibt jedoch widersprüchliche Modelle dafür, wie sich diese Vesikel zusammensetzen, und dies hat eine kritische Wissenslücke hinterlassen. Ein Modell ist das Modell mit konstanter Krümmung, bei dem die Krümmung gleichzeitig mit der Clathrin-Polymerisation induziert wird. Ein anderes, das Übergangsmodell von flach zu gekrümmt, besagt, dass sich zunächst ein flaches Gitter aus Clathrinmolekülen auf der Innenseite der Zellmembran ansammelt, gefolgt von einer Konformationsänderung, um die mit Clathrin beschichtete Grube und das Vesikel zu bilden.

Beweise für beide Modelle können durch Elektronenmikroskopie gesehen werden – aber das sind statische Momentaufnahmen von fixierten Zellen, die nicht die tatsächliche Dynamik im Nanometerbereich und mögliche Wege der Clathrin-vermittelten Endozytose offenbaren.

Jetzt füllen Alexa Mattheyses und Kollegen von der University of Alabama in Birmingham und der Emory University diese Wissenslücke, indem sie eine ausgeklügelte fluoreszenzmikroskopische Bildgebung namens STAR-Mikroskopie verwenden. Dadurch konnten sie die Clathrin-beschichtete Vesikelbildung in lebenden Zellen von der Initiierung bis zum Abschluss über Zeiträume von bis zu 100 Sekunden verfolgen.

Ihre Studie, berichtet in der Zeitschrift Naturkommunikationunterstützt das so genannte flexible Modell der Clathrin-beschichteten Vesikelbildung, das sowohl die konstant gekrümmten als auch die flach-zu-gekrümmten Übergangswege umfasst.

„Wir zeigen, dass die Clathrin-Akkumulation bei kurzlebigeren Clathrin-beschichteten Vesikeln vorzugsweise gleichzeitig mit der Krümmungsbildung erfolgt, bei langlebigeren Clathrin-beschichteten Vesikeln jedoch einen Übergang von flach zu gekrümmt bevorzugt“, sagte Mattheyses, außerordentlicher Professor an der UAB-Abteilung von Zell-, Entwicklungs- und Integrative Biologie. „Zusammengenommen liefern unsere Ergebnisse experimentelle Beweise zugunsten des flexiblen Modells der Endozytose, bei dem ein einziges Modell der Krümmungsbildung die Heterogenität der zellvermittelten Endozytosedynamik nicht umfassen kann.“

Simultaneous Two-wavelength Axial Ratiometry, oder STAR, Mikroskopie basiert auf Total Internal Reflection Fluoreszenz, oder TIRF, Mikroskopie, die die Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Proteinen an oder nahe der Plasmamembran über einen Abstand von etwa 100 bis 200 Nanometer ermöglicht. In der STAR-Mikroskopie wird das Protein mit zwei Fluorophoren markiert, die unterschiedliche Anregungswellenlängen haben, um die wellenlängenabhängige Eindringtiefe des evaneszenten Feldes auszunutzen. Das Ergebnis ist eine Fähigkeit, gleichzeitig sowohl die Proteinakkumulation, gemessen durch die Fluoreszenzintensität, als auch den Abstand von der Plasmamembran, gemessen durch das Fluoreszenzintensitätsverhältnis der zwei Fluorophore, aufzulösen. Dieser Abstand, der die z-Verteilung im Nanometerbereich darstellt, ist in der aktuellen Studie ein Maß für die Krümmung.

Unter Verwendung von Affennieren-Fibroblastenzellen markierten Mattheyses und Kollegen die Clathrin-CLCa-Leichtkette mit Fluorophoren, die Anregungswellenlängen von 488 und 647 Nanometern haben. Anschließend stimulierten sie die Zellen mit epidermalem Wachstumsfaktor, um Endozytose zu induzieren. Die quantitative Analyse unter Verwendung des Supercomputers UAB Cheaha führte zu 1.948 CLCa-STAR-Ansammlungen aus 13 Zellen.

Sie fanden Hinweise auf drei Modelle der Krümmungsinitiierung: Keimbildung, bei der die Krümmungsbildung weniger als eine Sekunde vor dem Auftreten von Clathrin begann; konstante Krümmung, wobei die Krümmungsbildung eine bis vier Sekunden nach Ankunft des Clathrins begann; und Übergang von flach zu gekrümmt, wobei die Krümmung mehr als vier Sekunden nach der Clathrin-Akkumulation begann.

Um die Daten weiter zu analysieren, gruppierten die Forscher endozytische Ereignisse basierend auf der Clathrin-Lebensdauer und den Modellen der Vesikelbildung. Dabei kamen interessante Features zum Vorschein.

„Wir fanden heraus, dass kurzlebige endozytische Ereignisse von weniger als 20 Sekunden überwiegend durch das Modell mit konstanter Krümmung gebildet wurden, während längere Ereignisse – mehr als 20 Sekunden – den Übergang von flach zu gekrümmt begünstigten“, sagte Mattheyses. „Der Anteil der Nukleationsereignisse war kleiner und begünstigte kurzlebige Ereignisse.“

Um zu testen, ob dieses flexible Modell der Clathrin-vermittelten Endozytose unter verschiedenen Zelllinien universell sein kann, bildeten die Forscher auch menschliche Nabelvenen-Endothelzellen ab, die durch vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor stimuliert wurden, um die Endozytose zu stimulieren. Sie fanden eine ähnliche Bandbreite an endozytischen Ereignissen.

„Diese Daten zeigen die bisher unbeachtete Heterogenität der Clathrin-vermittelten Endozytosedynamik und Plastizität der Clathrin-beschichteten Vesikelbildung, und sie legen nahe, dass verschiedene Zelltypen oder Ladungen diese Flexibilität nutzen können, um die Art der Krümmungsbildung zu beeinflussen“, sagte Mattheyses. „Zukünftige Forschung mit STAR-Mikroskopie wird definieren, wie die Rekrutierung von akzessorischen Proteinen und die Rolle biophysikalischer Parameter zur Vesikelbildung beitragen und wie sich unterschiedliche Clathrin-Dynamiken auf die Signalübertragung und die zelluläre Homöostase auswirken.“

Co-Autoren der Studie „Imaging vesicle formation dynamics support the flexible model of clathrin-mediated endocytosis“ sind Tomasz J. Nawara, Yancey D. Williams II, Tejeshwar C. Rao und Elizabeth Sztul, UAB Department of Cell, Developmental and Integrative Biologie; und Yuesong Hu und Khalid Salaita, Emory University Department of Chemistry, Atlanta, Georgia.