CRISPR-basierte Methode verbessert den Nachweis der Antibiotikaresistenz bei Abwasser

Antibiotikaresistenz ist ein globales Anliegen, das unsere Fähigkeit bedroht, bakterielle Infektionen beim Menschen und Tieren zu verhindern und zu behandeln. Um die Entstehung und Ausbreitung von Resistenz besser zu überwachen, haben Forscher des Carl R. Woese-Instituts für genomische Biologie eine CRISPR-angereicherte Metagenomik-Methode für die verstärkte Überwachung von Antibiotika-Resistenzgenen (Args) in Abwasser entwickelt.

Die Forschung ist veröffentlicht in der Zeitschrift Wasserforschung.

Während Antibiotika starke moderne Werkzeuge zur Bekämpfung von Infektionen sind, verändern sich die Bakterien und passen sich im Laufe der Zeit als Reaktion auf die Exposition gegenüber Antibiotika an und verringern daher die Wirksamkeit. Weit verbreitete Überbeanspruchung und Missbrauch von Antibiotika in der Gesundheits- und Lebensmittelindustrie beschleunigen dieses Problem weiter.

Über die direkte Exposition gegenüber Antibiotika hinaus wird auch die Resistenz zwischen verschiedenen Bakterien durch die Übertragung kleiner Stücke bakterieller DNA übertragen, die als Antibiotikaresistenzgene bezeichnet werden. Es gibt über 5.000 identifizierte Argumente, und diese Gene finden sich in klinischen Proben sowie in Wasserkörpern, die aus Krankenhäusern, Farmen und Abwassersystemen stammen.

„Argumente können die lebensrettende Kraft von Drogen, die zur Behandlung von Bakterieninfektionen eingesetzt werden, verringern“, sagte Helen Nguyen (Igoh), Professor für Bürger- und Umweltingenieurwesen an der Universität von Illinois Urbana-Champaign. „Die Abwassererkennung von Argumenten mit klinischer Bedeutung ermöglicht es öffentlichen Gesundheitsbehörden und Ärzten, zu antizipieren, was in Gemeinden zirkuliert.“

Abwasser enthält zahlreiche verschiedene Argumente, die mit genetischem Material aus verschiedenen Quellen gemischt sind, einschließlich Menschen, Viren und Bakterien. Da Args nur einen winzigen Prozentsatz des gesamten DNA -Gehalts ausmachen, erfordert die Aufdeckung in Abwasserproben empfindliche Erkennungsmethoden. Die häufigste Technik ist die quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR). Diese Methode verwendet RNA -Guides, die als Primer bezeichnet werden, um die spezifischen DNA -Sequenzen bekannter Argumente zu identifizieren, die dann zur Nachweis verstärkt werden.

„QPCR ist eine sensible Methode, zu der viele Menschen in der öffentlichen Gesundheit gut ausgebildet sind, aber es erfordert Primärdesign und Validierung, was sehr zeitaufwändig ist“, sagte Yuqing Mao, ein Doktorand in Zivil- und Umwelttechnik, der der erste Autor des Papiers war. „Da QPCR verwendet wird, um gezielte Gensequenzen herauszuziehen, bleibt das gesamte andere genetische Material in der Probe völlig unbekannt.“

Die zweite Methode, die Metagenomik, ist nicht so empfindlich wie qPCR, erfasst jedoch eine vollständigere Geschichte der genetischen Informationen, die in einer Stichprobe enthalten sind. Die Metagenomik beinhaltet das Aufbrechen aller Proben -DNA in Millionen kleinerer Fragmente, die gleichzeitig mit Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation sequenziert werden. Computeralgorithmen passen die vollständigen DNA -Sequenzen zum Vergleich mit Datenbanken zusammen, um ihre Identität zu bestimmen.

„Args machen weniger als 1% – wahrscheinlich noch näher an 0,1% – in der Stichprobe aus. Durch die Verwendung von Standardmethoden mit Metagenomik sind 99,9%der nachgewiesenen DNA nicht mit Argumenten verbunden“, sagte Mao.

Mao, Nguyen und ihr Mitarbeiter, Joanna Shisler, der mit der Abteilung für Mikrobiologie in Illinois verbunden ist, die Anzahl der arg-assoziierten Fragmente in den Proben bereicherte, nutzte das CRISPR-CAS9-System-ein hochwirksames Werkzeug für Gene-Bearbeitung.

Die DNA ist an zufälligen Stellen fragmentiert, wenn sie Standardmethoagenomik-Methoden verwenden, aber die Einbeziehung von cripsr-cas9 ermöglicht eine gezielte Fragmentierung innerhalb der Argumente. Durch die Gestaltung eines Pools von 6.010 verschiedenen Leitfaden -RNAs, die spezifisch an DNA an verschiedenen Stellen in Args binden könnten, könnte das Cas9 -Protein an diesen Stellen geschnitten werden.

„Unsere neue CRISPR -Methode erhöht die Häufigkeit von ARG -Fragmenten in der Stichprobe, was ihre Chancen erhöht, gelesen und nachgewiesen zu werden. CRISPR hat auch ein besseres Potenzial für Multiplex -Assays als für PCR, da die molekulare Wechselwirkung für CRISPR einfach und unkompliziert ist“, sagte Mao.

Ihre neue Methode senkte die Erkennungsgrenze der Argumente um eine Größenordnung von 10 bis 4 bis 10 bis 5 im Vergleich zu Standardmetagenomik und fand 1.189 weitere Argumente und 61 weitere Arg-Familien, die in Abwasserproben reichlich reichlich vorhanden sind.

Als Doktorand des sechsten Jahrs baute Mao dieses Projekt von Grund auf-über die wissenschaftlichen Hindernisse und lernte auf dem Weg viele neue Techniken. Sie sagte: „Als ich das erste Mal die Sequenzierungsergebnisse erzielte, erwartete ich nie, wie viel sensibler es mit der regulären Methode verglichen werden würde – es entdeckte viele weitere Argumente als wir dachten. Nachdem ich das Projekt beendet hatte, habe ich das Gefühl, ich bin aufgewachsen.“

Aber während diese Arbeit abgeschlossen ist, verfolgen Mao und Nguyen bereits mehrere neue Richtungen, einschließlich der Erweiterung der Anwendungen ihrer metagenomischen CRISPR-Cas9-Methode auf ein breiteres Spektrum von Umweltproben und die Verwendung ihrer Ergebnisse, um die Gestaltung neuer QPCR-Primer zu leiten.