Wissenschaftler entwickeln den autarken Proteintransport und den Gewebeaufbau in künstlichen Zellen

In einem neuen Naturkommunikation StudieWissenschaftler haben eine neuartige Methode entwickelt, mit der künstliche Zellen mit ihrer äußeren Umgebung interagieren können, ohne dass komplexe Modifikationsprozesse erforderlich sind.

Diese Methode könnte neue Grenzen in der Gewebezüchtung, der Arzneimittelabgabe und in Zellprozessen eröffnen.

Biologische Zellen werden durch eine Membran aus Phospholipiden geschützt, die die Interaktionen mit der Außenumgebung moduliert. Dies in künstlichen Zellen nachzubilden ist eine Herausforderung und erfordert eine manuelle externe Modifikation der Membran.

Dies gilt insbesondere für die Translokation oder Bewegung von Proteinen durch die Membran. Die vorliegende Studie geht dieses Problem an, indem sie eine Methode entwickelt, bei der künstliche Zellen ihre eigene Membran modifizieren.

Phys.org sprach mit zwei der Autoren der Studie, Prof. Neal K. Devaraj von der University of California, San Diego und Alexander Harjung, einem Doktoranden, der im Labor von Prof. Devaraj arbeitet.

Über die Motivation des Teams, diese neuartige Methode zu entwickeln, sagte Prof. Devaraj: „Die Rekonstitution von Membranproteinen in künstliche Systeme ist seit langem ein Problem in der Forschung an künstlichen Zellen.“

„Membranproteine ​​sind oft wasserunlöslich, was die Arbeit mit ihnen erschwert. Natürliche Zellen verfügen über komplexe Systeme, die sicherstellen, dass diese Proteine ​​effizient in Zellmembranen eingefügt werden können.“

Harjung fügte hinzu: „Für künstliche Zellen wäre es eine große Herausforderung, diese Membraninsertionssysteme wiederherzustellen. Deshalb sahen wir einen Bedarf an der Entwicklung eines viel einfacheren Systems für künstliche Zellen, um die Fähigkeit zu erlangen, ihre eigene Zellmembran zu funktionalisieren.“

Für die Studie wollten die Forscher die Zellmembran funktionalisieren, um den Proteintransport durch die Membran zu ermöglichen und sie anschließend zu gewebeähnlichen Strukturen zusammenzufügen.

Arbeiten mit α-Hämolysin

Biologische Kanäle nutzen typischerweise Ionenkanäle und Transporter, um Substanzen über die Membran auszutauschen. In künstlichen Zellen muss diese Interaktion manuell nachgebildet werden.

Prof. Devaraj erklärte: „Der Forscher kann die Membranzusammensetzung ändern, um dies zu erreichen, was sich stark von der Art und Weise unterscheidet, wie natürliche Zellen mit ihrer Umgebung interagieren.“

„Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine Methode entwickelt, mit der man Modifikationen der Außenmembran und damit die Interaktion mit der äußeren Umgebung in das künstliche Zellgenom kodieren kann.“

Dazu wählten die Forscher ein porenbildendes Protein namens α-Hämolysin. Dabei handelt es sich um ein Protein, das von Staphylococcus aureus produziert wird, dem Bakterium, das Staphylokokkeninfektionen verursacht. Fachlich wird es als Toxin bezeichnet, da es Löcher in Zellmembranen bildet.

Harjung erklärte die Gründe für die Wahl dieses Proteins: „Viele Forscher sind bereits damit vertraut, da es in künstlichen Zellen und bei der Nanoporensequenzierung weit verbreitet ist.“

„Es hat die einzigartige Fähigkeit, als lösliches Monomer exprimiert zu werden, das sich bei Kontakt mit einer Lipiddoppelschicht (Zellmembran) spontan zu einem Transmembranprotein zusammenfügt.“

Die Forscher nutzten das α-Hämolysin nicht nur als porenbildendes Protein, sondern modifizierten auch die künstlichen Zellen so, dass sie das Protein selbst produzierten. Da es sich um ein autarkes System handelt, müssen die Forscher das Protein nicht jedes Mal hinzufügen.

Einfügen von Peptiden und Erzeugen von α-Hämolysin-Mutationen

Um die Funktionalität von α-Hämolysin zu verbessern und den Porenbildungsprozess besser kontrollieren zu können, beschlossen die Forscher, es zu modifizieren.

Ihr Fokus lag insbesondere auf der Modifizierung der Membrantranslokationsschleife des Proteins, also des Teils des Proteins, der an der Translokation beteiligt ist.

Sie testeten Peptide unterschiedlicher Länge und Zusammensetzung. Peptide sind kurze Ketten aus Aminosäuren, die die Bausteine ​​von Proteinen sind. Sie verwendeten flexible Linker, kurze Aminosäureketten, die wie Brücken wirken und die Interaktion oder Bewegung zwischen verschiedenen Teilen des Proteins erleichtern.

Dieser Schritt verbessert die Zugänglichkeit des Peptids, sobald das Protein in die Zellmembran eingebettet ist.

„Der flexible Linker stellt sicher, dass das eingefügte Peptid nach der Translokation durch die Membran zugänglich ist. Durch Variation der Länge des Linkers konnten wir mehr über die Größe des Peptidinserts erfahren, das mit unserem System transloziert werden konnte“, erklärte Prof. Devaraj.

Die Forscher testeten verschiedene Peptide. His-Tag-Peptide – kurze Sequenzen von Histidin-Aminosäuren – wurden verwendet, um die Bewegung des α-Hämolysins auf seinem Weg und seiner Einbettung in die Zellmembran zu verfolgen.

Als nächstes verwendeten die Forscher zwei biologisch aktive Peptide, Somatostatin-14 und GLP-1, als Inserts in α-Hämolysin, um die Translokation zu testen.

Um ihre Ergebnisse zu validieren, verwendeten die Forscher mehrere Methoden, darunter einen GUV-Bindungs- und Leakage-Assay zum Testen von Peptid-Membran-Wechselwirkungen, Kryo-Elektronenmikroskopie zur Untersuchung der Proteinstruktur, Aufzeichnungen von Lipiddoppelschichtkanälen zur Beurteilung der Porenbildung und Antikörpererkennungsexperimente zur Bestätigung des Peptids Translokation.

Erfolgreiche Proteintranslokation

Das modifizierte α-Hämolysin gelangte erfolgreich zur Zellmembran und lagerte sich dort ein. Anschließend konnten die Peptideinfügungen erfolgreich durch die Membran translozieren und so den Proteintransport demonstrieren.

Peptide mit bis zu 50 Aminosäuren konnten in α-Hämolysin eingefügt werden, ohne die Porenbildung, Membraneinfügung und Proteinfunktionalität zu stören.

Die Forscher fanden außerdem heraus, dass die translozierten Peptide auf der Außenseite der Membran zugänglich blieben. Dies legt nahe, dass sie zum Aufbau gewebeähnlicher Strukturen verwendet werden könnten, da ihre Zugänglichkeit weitere Interaktionen und Organisation in der äußeren Umgebung ermöglicht.

Harjung erklärte dies mit den Worten: „Das System ermöglicht den Aufbau gewebeähnlicher Strukturen auf der Grundlage elektrostatischer Wechselwirkungen.“

„Durch die Erzeugung einer Population künstlicher Zellen, die negativ geladene Peptide über ihre Membran transportieren, und einer weiteren Population künstlicher Zellen, die positiv geladene Peptide translozieren, können wir eine gewebeähnliche Struktur erzeugen, da künstliche Zellen mit einer negativ geladenen Außenmembran an künstliche Zellen binden mit einer positiv geladenen Membran.“

Medikamentenverabreichung und künstliche Gewebe

Die Forscher fügten außerdem ein System hinzu, um zu erkennen, ob die Zellen miteinander kommunizieren können, wobei Zellen ein sichtbares (fluoreszierendes) Signal erzeugen, wenn sie ein Signal von anderen Zellen empfangen. Dies könnte bei der Schaffung komplexerer und funktionellerer künstlicher Gewebe für zukünftige Anwendungen helfen.

Mit der Möglichkeit, künstliche Gewebe und potenzielle Arzneimittelabgabesysteme zu entwickeln, stellt die neuartige Methode einen entscheidenden Schritt in der Zellforschung dar.

„Mit der Entwicklung von Biologika gewinnen Methoden für den effizienten Transport biologischer Makromoleküle in lebende Zellen in der Medizin zunehmend an Bedeutung“, sagte Prof. Devaraj.

Harjung fügte hinzu: „Ein besseres Verständnis der Membrantranslokation könnte zur Entwicklung von Werkzeugen für die Abgabe makromolekularer Therapeutika durch Lipidmembranen und in lebende Zellen führen.“

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