Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein leistungsstarkes Werkzeug in der Biologie, das es Forschern ermöglicht, die komplexe Welt von Zellen und Geweben auf molekularer Ebene zu visualisieren. Während diese Technik unser Verständnis biologischer Prozesse revolutioniert hat, bleibt die Abbildung großer und komplexer 3D-Strukturen wie Embryonen oder Organoide eine Herausforderung. Dies gilt insbesondere bei der Untersuchung komplizierter Details jenseits der optischen Auflösungsgrenze mithilfe der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM).
SIM verwendet mehrere unter strukturierter Beleuchtung aufgenommene Bilder, um ein hochaufgelöstes Bild zu rekonstruieren, das die Beugungsgrenze der herkömmlichen Mikroskopie überschreitet. Allerdings erfordert SIM die Aufnahme mehrerer Bilder für jeden Schnitt des 3D-Volumens, was zu langen Aufnahmezeiten und einer erhöhten Lichtbelastung lebender Proben führt.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, führte eine Zusammenarbeit zwischen dem Institut Fresnel an der Universität Aix Marseille und dem Centre de Biologie Intégrative an der Universität Toulouse in Frankreich zur Entwicklung eines neuen Mikroskoptyps namens Extended Depth-of-Field Random Illumination Microscopy (EDF-RIM). . Dieser innovative Ansatz kombiniert die Vorteile der hochauflösenden Mikroskopie mit einem erweiterten Tiefenschärfeerkennungsschema und ermöglicht die Erfassung ganzer Volumina in einem einzigen Bild. Die Arbeit ist veröffentlicht im Tagebuch Licht: Wissenschaft und Anwendungen.
EDF-RIM basiert auf der Random Illumination Microscopy (RIM), einer hochauflösenden Technik, die zufällige Speckle-Muster zur Beleuchtung nutzt. Diese Muster sind statistisch gesehen unempfindlich gegenüber Streuungen oder Aberrationen. RIM verwendet mehrere Bilder, die unter unterschiedlichen Speckle-Mustern aufgenommen wurden, um mithilfe eines numerischen Algorithmus, der die Varianz der Bilder analysiert, ein hochaufgelöstes Bild zu erzeugen. Durch diesen einzigartigen Ansatz eignet sich RIM besonders gut für die 3D-Bildgebung.
EDF-RIM beseitigt die Einschränkung, dass mehrere Bilder pro Schicht erforderlich sind, indem es ein erweitertes Tiefenschärfeerkennungssystem (EDF) integriert. Dieses System scannt die Brennebene schnell und projiziert so effektiv das gesamte 3D-Volumen auf ein einziges Bild. Dadurch wird die für die Bildaufnahme benötigte Zeit drastisch verkürzt und die Lichteinwirkung deutlich minimiert.
Es hat sich gezeigt, dass das EDF-RIM-System erhebliche Vorteile gegenüber der herkömmlichen EDF-Mikroskopie bietet, einschließlich eines verbesserten Kontrasts und einer zweifachen Verbesserung der Auflösung. Aufgrund der Projektionsnatur von EDF-RIM gehen jedoch axiale Informationen verloren.
Für Proben, bei denen die Fluoreszenz über eine gekrümmte Oberfläche verteilt ist, wie zum Beispiel Drosophila-Epithel, haben die Forscher eine Methode entwickelt, um die Oberflächentopographie abzuschätzen. Dies ermöglicht die Rekonstruktion eines seitlich hochaufgelösten 3D-Bildes mit genauer Darstellung der Objektform.
EDF-RIM stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Fluoreszenzmikroskopie dar und bietet eine effizientere und leistungsfähigere Möglichkeit, große und komplexe 3D-Strukturen abzubilden. Diese Technologie ist vielversprechend für die Weiterentwicklung unseres Verständnisses biologischer Prozesse, insbesondere in Bereichen, in denen Geschwindigkeit, Auflösung und minimale Lichteinwirkung entscheidende Faktoren sind.
Weitere Informationen:
Lorry Mazzella et al., Extended-Depth-of-Field Random Illumination Microscopy, EDF-RIM, bietet superaufgelöste projektive Bildgebung, Licht: Wissenschaft und Anwendungen (2024). DOI: 10.1038/s41377-024-01612-0