Das Gaublomme-Labor hat einen neuen optischen Pool-Screening-Ansatz namens CRISPRmap entwickelt, der die Kopplung optischer Eigenschaften einzelner Zellen mit gezielten genetischen Störungen ermöglicht. Optische Phänotypen sind für sequenzierungsbasierte Ansätze, die auf Zelllyse basieren, normalerweise nicht zugänglich, enthalten jedoch wichtige Informationen wie Zellmorphologie, subzelluläre Proteinlokalisierung, Zell-Zell-Interaktionen, extrazelluläre Matrixfaktoren und Gewebeorganisation.
CRISPRmap ermöglicht die ortsaufgelöste Abfrage der Genfunktion in Geweben und ermöglicht es Forschern, sowohl zellintrinsische als auch zellextrinsische Auswirkungen von Störungen abzubilden, die durch In-vitro-Studien nicht zugänglich sind. Dieser Ansatz eröffnet neue Wege zum Verständnis der Gene, die an der Rekrutierung von Immunzellen für Tumore, Metastasierung, Invasion, Angiogenese usw. beteiligt sind.
Die Gaublomme-Gruppe teilte ihre Ergebnisse kürzlich in einer Studie mit veröffentlicht In Naturbiotechnologie.
Die gepoolte Durchführung dieser Studien ermöglicht genetische Studien mit hohem Durchsatz, indem die Reaktionen vieler Zellen auf verschiedene genetische Störungen parallel gemessen werden. In gepoolten Analysen exprimiert jede Zelle RNA-Transkripte, die einen Barcode kodieren, der identifiziert, welche CRISPR-Störung in dieser Zelle aufgetreten ist.
Insbesondere ermöglicht CRISPRmap das optische Auslesen von Barcodes in anspruchsvollen Zelltypen und Kontexten, die zuvor mit anderen Methoden nicht erfasst wurden, einschließlich Stammzellen, abgeleiteten Neuronen und In-vivo-Zellen in Gewebekontexten. Nachdem Wissenschaftler identifiziert haben, welches Gen in einer bestimmten Zelle gestört ist, können sie etwas über die Reaktion von Zellen und ihrer Umgebung auf diese Störung erfahren.
„Unser Labor hat CRISPRmap so optimiert, dass es mit optischen Auslesetests kompatibel ist und eine gleichzeitige Multiplex-Profilierung von Proteinen und mRNA-Spezies ermöglicht. Darüber hinaus ist CRISPRmap unabhängig von der Art der genetischen Störung und eröffnet den Weg zur Erforschung gezielter Mutationen, Geninterferenz und -aktivierung sowie der Epigenetik.“ Modifikation und CRISPR-RNA-Bearbeitung“, erklärte Professor Jellert Gaublomme, korrespondierender Autor der Studie.
In Zusammenarbeit mit dem Ciccia-Labor am Irving Medical Center der Columbia University verwendeten die Autoren CRISPRmap, um die funktionellen Konsequenzen von 292 Mutationen in 27 Genen zu untersuchen, die für die DNA-Schadensreaktion entscheidend sind, und visualisierten die Rekrutierung von DNA-Schadensreparaturproteinen an DNA-Schadensstellen.
Sie bewerteten diese Reaktionen nach ionisierender Strahlung oder DNA-schädigenden Wirkstoffen, die üblicherweise als Chemotherapeutika bei Brustkrebs eingesetzt werden. Die Profilierung der Expression und subzellulären Lokalisierung von Dutzenden von Proteinen und mRNA-Spezies in etwa einer Million Zellen ermöglichte eine differenzierte Untersuchung unterschiedlicher Einflüsse auf die DNA-Schadensreaktion.
„Diese Methode ermöglichte es uns, Missense-Varianten mit ungewisser klinischer Bedeutung zu identifizieren, deren Reaktion bekannten pathogenen Varianten ähnelt. Daher kann unser Ansatz einen Rahmen für die behandlungsspezifische Kommentierung menschlicher Varianten bieten und dabei helfen, therapeutische Strategien zu priorisieren“, beschrieb Jiacheng Gu, der Erstautor der Studie.
Über die Untersuchung von in einer Schale gezüchteten Krebszelllinien hinaus demonstrierten die Forscher ihre CRISPRmap-Barcode-Erkennung in Krebszellen in der Tumormikroumgebung, ein wichtiges Ziel des New Innovator Award des NIH-Direktors, den das Labor erhielt.
In Zusammenarbeit mit dem Chan-Labor erstellten sie ein Profil von Tumorabschnitten mit CRISPRmap-Barcode-Erkennung und kombinierten die Auslesung mit einer Multiplex-Antikörperfärbung, um die Angiogenese, die Bildung extrazellulärer Matrix um Tumordomänen herum und die Kerntranslokation des Transkriptionsfaktors in den transplantierten Zellen sichtbar zu machen.
Da CRISPRmap auf verschiedene CRISPR-Modalitäten und Zelltypen anwendbar ist, kann die Technik für ein breites Forschungsspektrum in Biologie und Medizin eingesetzt werden. „Wir haben unseren Ansatz für eine breite Zugänglichkeit optimiert, da er für die Barcode-Erkennung nicht auf Sequenzierungsreagenzien von Drittanbietern angewiesen ist, Auslesefarbstoffe an die für Forscher verfügbaren Mikroskope angepasst werden können und der Ansatz kostengünstig ist“, erklärte Gu.
„Wir gehen davon aus, dass dies einzelne Labore weiter in die Lage versetzen wird, Störungsstudien in ihrem interessierenden Zelltyp durchzuführen und biologische Signalwege in einem Ausmaß zu untersuchen, das der Anzahl der Gene entspricht, von denen bekannt ist, dass sie eine Rolle in dem Signalweg spielen“, fügte Gaublomme hinzu.
Das Gaublomme-Labor plant, die Auswirkungen von Genstörungen auf die Gewebearchitektur und das Zusammenspiel zwischen Zellen in komplexen Mikroumgebungen zu untersuchen. Weitere Studien könnten sich auf von Patienten stammende Organoide konzentrieren, um die Genfunktion in Gewebe- und krankheitsspezifischen Kontexten zu untersuchen.
„Wir stellen uns vor, dass CRISPRmap optische Phänotypen über ein breites Spektrum biologischer Längenskalen hinweg aufklären kann, von molekularen Skalen wie DNA-Schadensbruchherden in einem einzelnen Zellkern bis hin zur zellulären Reorganisation über ganze Organe hinweg.“
„Der Ansatz könnte auf Studien angewendet werden, die von der Grundlagenbiologie über Krankheitsmechanismen bis hin zur Optimierung therapeutischer Ansätze in der Entwicklung, neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs reichen“, schlussfolgerte Gaublomme.
Weitere Informationen:
Jiacheng Gu et al, Kartierung multimodaler Phänotypen auf Störungen in Zellen und Gewebe mit CRISPRmap, Naturbiotechnologie (2024). DOI: 10.1038/s41587-024-02386-x