Ein Leitfaden zur Durchflusszytometrie zur genauen Schätzung der Pflanzengenomgröße

Eine kürzlich von Forschern der North Carolina State University veröffentlichte Studie bietet neue Erkenntnisse und Richtlinien für die genaue Schätzung der Pflanzengenomgröße mithilfe der Durchflusszytometrie.

Die Durchflusszytometrie wird seit mehr als 50 Jahren häufig zur Schätzung der relativen und absoluten Genomgröße (DNA-Gehalt) von Pflanzen eingesetzt. Die Genauigkeit dieser Schätzungen kann jedoch aufgrund vieler Faktoren, einschließlich Fehlern bei den Schätzungen der Genomgröße von Referenzstandards und verschiedenen experimentellen Methoden, stark variieren.

Diese neueste Forschung überprüft lang gehegte Annahmen, identifiziert Variationsquellen und etabliert Best Practices und Referenzstandards mit aktualisierten Genomgrößen, um die Präzision und Zuverlässigkeit der Genomgrößenschätzung zu verbessern. Außerdem werden die verwendeten Methoden kritisch untersucht und Richtlinien zur Beseitigung von Inkonsistenzen und zur Verbesserung der Genauigkeit bereitgestellt. Die Forschung ist veröffentlicht im Zeitschrift der American Society for Horticultural Science.

Die spezifischen Ziele dieser Studie bestanden darin, die Genomgrößen häufig verwendeter Referenzstandards neu zu bewerten und Variations- und Fehlerquellen bei der Schätzung der Pflanzengenomgrößen zu quantifizieren, die aus Puffern, der Verwechslung von Pflanzengeweben, Gewebetypen und Pflanzenreferenzstandards unter Verwendung von 4′,6 entstehen -Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und Propidiumiodid (PI) Fluorochrome. Zur Klärung dieser Ziele wurden fünf separate Studien durchgeführt.

Die erste Studie konzentrierte sich auf Fluorochromeffekte. In der Durchflusszytometrie von Pflanzen werden verschiedene Fluorochrome verwendet, ihre Wirksamkeit bei der Färbung des gesamten Genoms, der Einfluss von Chromatin auf die Wirksamkeit der Färbung und der Einfluss von Puffern und Pflanzenmetaboliten auf die Farbstofffluoreszenz sind jedoch weitgehend unbekannt.

Aufgrund von Unterschieden in der Färbung, Basenpaarverzerrungen und Inkubationszeiten wurden bei verschiedenen Fluorochromen erhebliche Unterschiede in der geschätzten Größe des Pflanzengenoms beobachtet. Darüber hinaus beeinflussen Faktoren wie die Wirksamkeit der Färbung von dicht gepacktem Chromatin und die Empfindlichkeit der Fluoreszenz gegenüber störenden Metaboliten auch die Genauigkeit der Schätzung der Genomgröße.

Die zweite Studie untersuchte Puffereffekte, die für die Kernisolierung und -färbung bei der Probenvorbereitung für die Durchflusszytometrie von entscheidender Bedeutung sind. Zu diesen Puffern, die getrennt oder kombiniert vorliegen können, gehören häufig Tenside, isotonische Mittel, pH-Puffer, phenolische Bindemittel (wie Polyvinylpyrrolidon), DNA-konservierende Verbindungen (wie Spermin) und RNA oder proteinabbauende Enzyme.

Aufgrund der Vielfalt an Gewebetypen, Morphologie und Metabolitenzusammensetzungen sind Puffer für spezifische Anwendungen optimiert, wobei üblicherweise bis zu 28 verschiedene Puffer verwendet werden.

Metaboliteneffekte wurden in der dritten Studie kategorisiert. Verschiedene Sekundärmetaboliten in Pflanzen können je nach Taxa und Gewebe erheblich variieren, was zu Fehlern bei der Schätzung der Genomgröße mithilfe der Durchflusszytometrie führt. Verbindungen wie Anthocyane, Koffein, Chlorogensäure, Cumarine, Ellagsäure, Gerbsäure und andere können mit Fluorochromen und Kern-DNA interagieren und zu einer Unter- oder Überschätzung der Genomgröße führen.

Die vierte Studie zu Gewebetypeffekten ergab, dass die Wahl des Pflanzengewebes die Schätzung der Genomgröße mithilfe der Durchflusszytometrie erheblich beeinflusst. Zu den Faktoren, die dies beeinflussen, gehören das Ursprungsorgan, der Zustand des Gewebes (lebendig, tot oder fixiert) und das Vorhandensein zytosolischer Verbindungen. Unterschiedliche Sekundärmetaboliten in unterschiedlicher Art und Menge in verschiedenen Geweben können gewebespezifische Störungen verursachen.

Referenzstandardeffekte bildeten die fünfte Studie. In der Durchflusszytometrie ist die Einbeziehung eines Referenzstandards mit bekannter Genomgröße entscheidend für die genaue Berechnung der Genomgröße einer unbekannten Probe. Überarbeitete Schätzungen der Genomgrößen häufig verwendeter pflanzlicher Referenzstandards wurden unter Verwendung menschlicher männlicher Leukozyten als Primärstandard mit einer aktualisierten Genomgröße (6,15 pg; 12,14 % niedriger als in früheren Studien) unter Verwendung von DAPI- und PI-Fluorochromen ermittelt.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Durchflusszytometrie die relative Größe und Ploidie des Pflanzengenoms präzise und wiederholt bestimmen kann, was sie bei Verwendung konsistenter Methoden für eng verwandte Pflanzen wertvoll macht. Die genaue Bestimmung der absoluten Genomgröße bleibt jedoch eine Herausforderung und sollte als Näherungswert betrachtet werden, mit möglichen Fehlern von ±29 % oder mehr.

Zu den Faktoren, die die Genauigkeit beeinflussen, gehören Fluorochrom, Extraktionspuffer, Gewebetyp, Referenzstandard und pflanzliche Metaboliten, die die Fluorochrombindung und Fluoreszenz beeinflussen können.

Insgesamt kann die Durchflusszytometrie unabhängig vom Fluorochrom präzise, ​​wiederholbar und äußerst wertvoll für die Bestimmung der relativen Genomgröße und Ploidie eng verwandter Pflanzen sein, wenn konsistente Methoden verwendet werden.

Eine genaue Bestimmung der absoluten Genomgröße mittels Durchflusszytometrie ist jedoch noch nicht möglich, und Schätzungen der Genomgröße mithilfe der Durchflusszytometrie sollten als grobe Näherungen betrachtet werden, die je nach experimentellen Methoden und Pflanzenumgebungen um ±29 % oder mehr variieren können. Zusätzliche Empfehlungen zu Best Practices werden bereitgestellt.

Die Implikationen dieser Studie sind für Forscher, Züchter und Biotechnologen von Bedeutung. Eine genaue Schätzung der Genomgröße ist für eine Vielzahl von Anwendungen von entscheidender Bedeutung, darunter Pflanzenzüchtung, genetische Kartierung und Biodiversitätsstudien. Es wird erwartet, dass die durch diese Studie festgelegten neuen Richtlinien und Referenzstandards die Genauigkeit und Präzision der Durchflusszytometrie zur Schätzung der Pflanzenzwerggröße weiter verbessern.

Den Autoren zufolge ist die Durchflusszytometrie ein äußerst wertvolles Werkzeug zur schnellen Abschätzung der Pflanzenploidie und der relativen Genomgröße, da unsere Labore aktiv an Pflanzenzüchtung, Genetik, Zytogenetik und Pflanzenverbesserung beteiligt sind. Da wir diese Technologie jedoch schon seit Jahrzehnten nutzen, Es wurde deutlich, wie stark diese Schätzungen methodischen Schwankungen unterliegen.

„Da die Durchflusszytometrie bei Verwendung konsistenter Methoden präzise und wiederholbar ist, wird oft fälschlicherweise angenommen und behauptet, sie sei ‚genau‘. In dieser Studie konnten wir die Genomgrößen häufig verwendeter Referenzstandards neu bewerten und Variations- und Fehlerquellen bei der Schätzung der Pflanzengenomgrößen quantifizieren, die durch die Verwendung unterschiedlicher Gewebe und Methoden entstehen und zu Fehlern von ±29 % oder mehr führen können.

„Darüber hinaus führte die Verwendung von Referenzstandards mit veralteten Genomgrößenschätzungen zu zusätzlichen Fehlern von 12 % oder mehr. Diese Forschung liefert verbesserte Schätzungen der Genomgrößen von Referenzstandards, quantifizierte Fehlerquellen und empfohlene Best Practices für verbesserte Schätzungen der Pflanzengenomgröße.“ „