Strategien zur Maximierung der rekombinanten Proteinproduktion in Tabakpflanzen

Plant Molecular Farming (PMF) ist eine moderne, hochentwickelte Technologie, die die biosynthetische Maschinerie von Pflanzen nutzt, um eine Vielzahl rekombinanter Proteine ​​zu synthetisieren, darunter auch Enzyme für industrielle und therapeutische Zwecke. Gegenüber traditionellen Ansätzen wie mikrobieller Fermentation und Säugetierzellkulturen bietet PMF mehrere Vorteile, darunter geringere Kosten, hohe Produktionserträge und das Fehlen menschlicher Krankheitserreger und Endotoxine. Pflanzen bieten außerdem eine beträchtliche Flexibilität, die eine maßgeschneiderte Proteinproduktion ermöglicht.

Tabakarten wie Nicotiana benthamiana und Nicotiana tabacum sind dafür bekannt, dass sie eine eingeschränkte basale Immunität und einen weniger robusten Ribonukleinsäure-(RNA-)Silencing-Pfad aufweisen, der den Abbau fremder RNA als Abwehrmechanismus beinhaltet. Dies, zusammen mit ihrem kurzen Lebenszyklus und ihrer großen Biomasseproduktionskapazität, macht sie zu einer idealen Wahl für eine schnelle und effiziente rekombinante Proteinproduktion.

Trotz dieser zahlreichen Vorteile gibt es bei der Proteinproduktion jedoch gewisse Einschränkungen. Tabakzellen müssen so manipuliert werden, dass jedes rekombinante Protein gezielt unter der Zelle lokalisiert werden kann.

Während mehrere Studien die rekombinante Proteinproduktion in Tabak untersuchten, war eine umfassende Studie über subzelluläre Lokalisierungsstrategien erforderlich. Eine in BioDesign Forschung befasst sich mit diesem Problem und konzentriert sich auf Zielstrategien zur Lenkung der rekombinanten Proteine ​​in vier subzelluläre Kompartimente – Endoplasmatisches Retikulum (ER), Vakuole, Chloroplast und Apoplast.

Dr. Shi-Jian Song, ein Forscher an der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften in China und einer der korrespondierenden Autoren dieser Studie, liefert weitere Hintergrundinformationen und sagt: „Die Optimierung der subzellulären Lokalisierung einzelner Zielproteine ​​ist für eine erfolgreiche Proteinsynthese und ihre Nutzung in der Pharmaindustrie von entscheidender Bedeutung.“

Das ER ist für die Lokalisierung rekombinanter Proteine ​​bekannt, da es molekulare Chaperons beherbergt, die die Proteinfaltung unterstützen und außerdem das Risiko des Proteinabbaus minimieren. Proteine, die auf das ER gerichtet sind, unterliegen einer homogenen Glykosylierung, einer Reaktion, bei der Kohlenhydrate hinzugefügt werden, was für viele therapeutische Proteine ​​unerlässlich ist. Die Anreicherung rekombinanter Proteine ​​im pflanzlichen ER kann durch die Einfügung eines N-terminalen, spezifischen ER-Ziel- oder Sekretionssignalpeptids zusammen mit einer C-terminalen Retentionssequenz erreicht werden.

Dr. Inhwan Hwang, der andere korrespondierende Autor dieser Studie, weist auf die Einschränkungen der Studie hin und erwähnt: „Eine Überlastung des ER kann zu ER-Stress führen, was in solchen Fällen zu einer deutlich reduzierten Proteinausbeute führt.“ Dies kann vermieden werden, wenn während der Expressionsstufen sorgfältig vorgegangen wird.

Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass die ER-Lokalisierung optimal für große, komplexe Glykoproteine ​​(Proteine ​​mit angehängten Kohlenhydraten) ist, die Chaperons zur Faltung benötigen. Diese Glykoproteine ​​haben ein Muster von Kohlenhydraten, die an das Stickstoffatom angehängt sind, ähnlich wie Säugetierproteine.

Die Pflanzenvakuole ist ein weiteres wichtiges Organell im Tabak und nimmt etwa 80 bis 90 % des Zellvolumens in Tabakblättern ein. Die PMF-Technologie nutzt diese enorme Speicherkapazität zur Lokalisierung rekombinanter Proteine. Vakuolensortierungssignale, die entweder ortsspezifisch oder sequenzspezifisch sein können, sind für die Vakuolenzielausrichtung von entscheidender Bedeutung.

Dr. Hai-Ping Diao weist auf einen interessanten Aspekt dieser Vakuolen hin: „Die Proteine ​​können über verschiedene Transportwege in die Vakuole gelangen. Durch Rekombination wird sichergestellt, dass das Protein unter Umgehung des Golgi-Apparats direkt vom ER zur Vakuole transportiert wird.“

Bestimmte Proteine ​​neigen auch dazu, in der Vakuole abgebaut zu werden, da dort ein Abbauenzym namens Protease vorhanden ist. Daher ist es am besten, die Proteine ​​zu lokalisieren, die säurebeständig sind oder von Natur aus im menschlichen Lysosom lokalisiert sind.

Chloroplasten im Tabakblattgewebe speichern die größte Menge an nativen Proteinen und sind daher ideal für die Ansammlung großer Mengen rekombinanter Proteine. Es gibt zwei Hauptstrategien für die Ansammlung großer Mengen rekombinanter Proteine: die Chloroplastentransformation und die Kerntransformation.

Die Chloroplastentransformation ermöglicht die stabile Expression fremder Gene, optimale Bedingungen für die Proteinfaltung und ein minimales Risiko einer Übertragung in die Umwelt. Die Erzeugung gentechnisch veränderter Pflanzen mit hohem Ertrag ist mit diesem Verfahren jedoch aufgrund bestimmter technischer Herausforderungen schwierig und zeitaufwändig.

Bei der Kerntransformation hingegen wird ein rekombinantes Protein mit einem Chloroplasten-Transitpeptid fusioniert, was eine schnellere Proteinproduktion ermöglicht. Die Studie zeigt, dass die Chloroplastenlokalisierung am besten für Proteine ​​funktioniert, die keine umfangreichen biochemischen Modifikationen erfordern.

Der Apoplast, ein wichtiger Raum zwischen Zellmembran und Zellwand in Pflanzenzellen, gilt als hervorragender Ort für die Ansammlung rekombinanter Proteine. Die Proteinansammlung im Apoplast vereinfacht zudem die Aufreinigungsmethode.

Während die kleineren rekombinanten Proteine ​​direkt aus der Apoplastflüssigkeit extrahiert werden können, erfordern große Proteinkomplexe einen herkömmlichen Reinigungsprozess. Rekombinante Proteine ​​können aufgrund der Anwesenheit von Proteasen im Apoplast auch eine beeinträchtigte strukturelle Integrität aufweisen. Um diese Komplikation zu vermeiden, wird zunehmend die Koexpression eines Proteaseinhibitors als neue Strategie eingesetzt.

PMF hat das Potenzial, die Produktion rekombinanter Proteine ​​zu revolutionieren. Allerdings bleiben anpassbare Produktionsniveaus, vergleichbare Qualitäten und Kostenprobleme bestehen. Dr. Shi-Jian Song führt weiter aus: „Um die Verwendung gentechnisch veränderter Pflanzen in der industriellen Forschung zu normalisieren, ist es wichtig, Protokolle strikt einzuhalten, die öffentliche Beteiligung zu verbessern und strenge Sicherheitsprotokolle zu befolgen.“

Die Umgestaltung des Tabakpflanzen-Chassis, einschließlich der Verarbeitung von Proteasen mit geringer Effizienz, die effektive Ressourcenverteilung und die Entwicklung eines toxinfreien Pflanzenreaktors können zu weiteren Fortschritten beitragen. Die letztendliche Kommerzialisierung der Bioproduktion ist ein entscheidendes Zeichen für die Entwicklung von PMF.