Neuer Biosensor beleuchtet physiologische Signale bei lebenden Tieren

Eric Schreiter und Luke Lavis dachten, sie hätten es herausgefunden. Im Jahr 2021 berichteten die Leiter der Janelia-Gruppe, dass sie eine Methode entwickelt hätten, um Schreiters konstruierte Protein-Biosensoren und Lavis‘ helle, fluoreszierende Janelia Fluor-Farbstoffe zu kombinieren.

Diese Sensoren, die verschiedene physiologische Signale verfolgen und sie mit fernrotem Licht hell beleuchten könnten, würden es Wissenschaftlern theoretisch ermöglichen, Bilder an lebenden Tieren zu machen und gleichzeitig mehrere physiologische Signale zu verfolgen – zwei Aspekte der biologischen Bildgebung, die mit vorhandenen Sensoren nur schwer zu bewerkstelligen waren. Fernrotes Licht kann tiefer in Gewebe eindringen als andere Wellenlängen und es gibt den Wissenschaftlern eine zusätzliche Farbe, die sie neben den typischen Farbtönen wie Grün und Rot verwenden können, die in der biologischen Bildgebung verwendet werden.

„Alles war großartig, es war fantastisch und wir waren glücklich – bis wir versuchten, die Sensoren bei Tieren einzusetzen, und es praktisch völlig fehlschlug“, erinnert sich Schreiter. „Das war ein bisschen enttäuschend.“

Glücklicherweise war Helen Farrants gerade für ihre Postdoc-Stelle in Schreiters Labor in Janelia angekommen und sie nahm die Herausforderung an, die Protein-Biosensoren so neu zu entwickeln, dass sie ihrem ursprünglichen Zweck entsprachen.

Farrants begann von Grund auf und entwickelte eine neue Art und Weise, wie die konstruierten Protein-Biosensoren und die JF-Farbstoffe zusammenarbeiten konnten. Damit konnte das Team sein Ziel erreichen, physiologische Signale bei lebenden Tieren zu messen. Ihr erster Proof-of-Principle-Sensor, genannt WHaloCaMPkann Kalziumsignale – ein wichtiger Teil der zellulären Kommunikation – in lebenden Fruchtfliegen, Zebrafischen und Mäusen erkennen.

Mit der neuen Technik lassen sich auch zahlreiche Sensoren zur Verfolgung anderer interessanter Signale entwickeln. Die Möglichkeit, diese physiologischen Signale bei lebenden Tieren zu erkennen, könnte Biologen Einblicke in die Zusammenarbeit von Zellen, Geweben und Organen bei der Ausführung wichtiger Funktionen geben.

„Helen hat von Grund auf neu angefangen und die ganze Strategie zur Kombination von Farbstoffen und Protein-Biosensoren neu entwickelt“, sagt Schreiter. „WHaloCaMP ist die erste Demonstration, aber es wird nicht die letzte sein. Es wird wirklich eine neue allgemeine Strategie auf dem Gebiet der Herstellung fluoreszierender Biosensoren zur Bildgebung der Physiologie sein, insbesondere im fernen Rot.“

Einen neuen Weg beschreiten

Die größte Hürde, die Farrants und das Team überwinden mussten, bestand darin, einen anderen Weg zu finden, um den Protein-Biosensor und den JF-Farbstoff zusammenarbeiten zu lassen.

Die ersten Sensoren, die das Team baute, basierten auf Farbstoffen, die ihre Form verändern und fluoreszieren. Diese Farbstoffe konnten jedoch nicht in tierisches Gewebe eindringen – ein Problem, das deutlich wurde, als das Team versuchte, den Sensor an lebenden Tieren einzusetzen und keine Signale erkennen konnte.

Nachdem Farrants über ein Jahr lang verschiedene Strategien ausprobiert hatte, kam er auf die Idee, die Fluoreszenz nicht durch eine Veränderung der Form des Farbstoffs, sondern durch bestimmte Teile des Sensorproteins ein- und auszuschalten. Das Team fügte dem gentechnisch veränderten Proteinsensor in der Nähe des Farbstoffs eine Aminosäure namens Tryptophan hinzu. Kommt der Farbstoff in engen Kontakt mit dem Tryptophan, wird der Farbstoff ausgeschaltet. In Gegenwart von Kalzium verändert das Protein seine Form – das Tryptophan entfernt sich vom Farbstoff und der Farbstoff wird eingeschaltet.

„Anderthalb Jahre lang hat nichts funktioniert, aber ich erinnere mich noch an den Tag, als ich diese Tryptophan-Änderung vornahm und beim Hinzufügen von Kalzium nur eine winzige Veränderung in der Fluoreszenz sah. Ich wusste, dass wir zumindest einen Ausgangspunkt hatten – wir hatten einen Haken“, erinnert sich Farrants.

Signale sehen

Durch die Verwendung von Tryptophan zur Modulation der Farbstofffluoreszenz konnten Farbstoffe verwendet werden, die leicht vom Gewebe aufgenommen werden und bei lebenden Tieren eingesetzt werden können.

Die Forscher zeigten, dass WHaloCaMP zur Erkennung von Kalziumsignalen in lebenden Fruchtfliegen, Zebrafischen und Mäusen verwendet werden kann. Sie zeigten auch, dass es zusammen mit anderen Sensoren verwendet werden kann, um mithilfe unterschiedlicher Farben bis zu drei Signale gleichzeitig zu erkennen. Bei Zebrafischen zeigten sie, dass sie gleichzeitig Glukoseänderungen in Zellen, Kalziumsignale in Muskeln und Kalziumsignale in Neuronen erkennen können.

Das Team arbeitet derzeit mit Janelias GENIE-Projektteam an der Entwicklung einer verbesserten Version von WHaloCaMP. Außerdem arbeiten sie mit Biologen von Janelia zusammen, um die neue Strategie zu nutzen, um Sensoren zur Erkennung anderer physiologischer Signale zu entwickeln und Sensoren mit zusätzlichen JF-Farbstoffen herzustellen. Das Team hat seine Strategie zum Bau der Biosensoren auch der breiteren Forschungsgemeinschaft zugänglich gemacht, und andere Gruppen haben begonnen, zusätzliche Versionen der Sensoren zu entwickeln.

Farrants sagt, das Projekt wäre ohne die Interaktion und Zusammenarbeit bei Janelia nicht möglich gewesen. Diese ermöglicht es ihr und anderen Chemikern, die Werkzeuge zu entwickeln, die Biologen brauchen und wollen.

„Ich bastele wirklich gern an Dingen herum und baue Werkzeuge, aber wenn ich weiß, dass das, was ich baue und bastele, eine Anwendung hat, die für jemanden von Interesse ist, dann macht es meiner Meinung nach Spaß und ist lohnend“, sagt Farrants. „Das ist es, was ich an Janelia mag: Man kann täglich mit Menschen interagieren. Das passiert auch in der weiteren wissenschaftlichen Welt, aber Janelia ist ein besonderer Ort.“