Ein von Rui Benedito geleitetes Wissenschaftlerteam des Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) hat ein neuartiges genetisches Werkzeug namens iSuRe-HadCre entwickelt, das die Induktion präziser genetischer Veränderungen in ganzen Geweben oder in einzelnen Zellen mit hoher Effizienz und Zuverlässigkeit ermöglicht. Diese neue Technologie dürfte zu einem wichtigen Werkzeug in der biomedizinischen Forschung werden, die Mausmodelle verwendet, um die Genfunktion zu verändern und zu verstehen.
Jahrzehntelang war die konditionelle Cre-Rekombinase-Genetik die Goldstandardmethode zur Analyse der Genfunktion, die eine präzise Kontrolle über genetische Veränderungen oder die Genexpression bietet. Trotz der Entwicklung neuer Gen-Targeting-Technologien wie CRISPR/Cas9 bleibt das Cre-Lox-System in Mausmodellen in seiner Effizienz, Präzision und breiten Anwendbarkeit in der biomedizinischen Forschung unübertroffen. Mit dieser Methode können Forscher die Genexpression zeitlich und räumlich manipulieren und so die Genfunktion in bestimmten Geweben und in bestimmten biologischen oder Krankheitskontexten untersuchen.
Ein großer Nachteil des Cre-Lox-Systems ist jedoch seine unvermeidliche Variabilität in der Effizienz und zeitlichen Kontrolle der Cre-vermittelten Rekombination, abhängig von den verwendeten spezifischen Transgenen und floxierten Allelen. Diese Variabilität erfordert den Einsatz vielfältiger und kostspieliger genetischer und molekularer Kontrollen, um zu bestätigen, dass jedes Cre-abhängige konditionelle genetische Experiment wie beabsichtigt funktioniert hat.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelte das von Benedito geleitete CNIC-Team zuvor die iSuRe-Cre-Technologie, ein transgenes Mausmodell, das permanente Cre-Aktivität mit der Expression eines fluoreszierenden Reporters verknüpfte. Dadurch wurde das Problem falscher Positivergebnisse und die Notwendigkeit kostspieliger zusätzlicher Prüfungen und Kontrollen zur Validierung der angemessenen Modifikation der Zielgene überwunden.
Dennoch wies dieses iSuRe-Cre-Allel der ersten Generation noch Einschränkungen auf, darunter sporadische Undichtigkeiten bei einigen Zelltypen, eine relativ geringe Empfindlichkeit gegenüber Cre-Aktivität und das Potenzial für Toxizität in Zellen mit hoher und permanenter Cre-Expression.
In der neuen Studie entwickelte das CNIC-Team ein neues genetisches Werkzeug namens iSuRe-HadCre, das diese Einschränkungen überwindet. „Dieses Werkzeug verwendet eine neuartige induzierbare genetische Kaskade dualer Rekombinase, die die Expression eines fluoreszierenden Reporters in allen Zellen sicherstellt, die zuvor eine hohe Cre-Aktivität aufwiesen, dies aber nicht mehr tun“, sagte Erstautorin Irene García González.
Die Arbeit ist veröffentlicht im Journal Nukleinsäureforschung.
García González erklärte, dass „diese vorübergehende Expression von Cre ausreicht, um alle von loxP flankierten Gene effektiv zu löschen und gleichzeitig die durch die permanente Expression von Cre verursachte Toxizität zu vermeiden. Darüber hinaus ist das neue System in keinem Zelltyp undicht und reagiert viel empfindlicher auf die Induktion durch CreERT2 und seinen Liganden Tamoxifen.“
Benedito prognostiziert, dass „diese Eigenschaften und die überlegene Leistung von iSuRe-HadCre es zu einem unverzichtbaren Werkzeug für alle Labore machen werden, die bedingte genetische Studien mit Mausmodellen durchführen.“
Benedito fügte hinzu, dass iSuRe-HadCre „besonders wertvoll für Bildgebungsstudien, genetische Einzelzellanalysen und genetische Epistasestudien sein wird, bei denen die gleichzeitige Modifikation mehrerer Gene mit hoher Effizienz und Zuverlässigkeit erforderlich ist.“
Mehr Informationen:
Irene Garcia-Gonzalez et al, iSuRe-HadCre ist ein unverzichtbares Werkzeug für effektive konditionelle Genetik, Nukleinsäureforschung (2024). DOI: 10.1093/nar/gkae472
Zur Verfügung gestellt vom Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (FSP)