Neue Technik zur Erfassung kurzlebiger RNA-Moleküle zeigt, wie die Gentranskription in Zellen koordiniert wird

Das menschliche Genom enthält etwa 23.000 Gene, aber nur ein Bruchteil dieser Gene ist zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle aktiviert. Das komplexe Netzwerk von regulatorischen Elementen, das die Genexpression steuert, umfasst Genombereiche, die als Enhancer bezeichnet werden und sich oft weit entfernt von den Genen befinden, die sie regulieren.

Diese Distanz kann es schwierig machen, die komplexen Interaktionen zwischen Genen und Enhancern abzubilden. Um dieses Problem zu lösen, haben MIT-Forscher eine neue Technik entwickelt, mit der sie den Zeitpunkt der Gen- und Enhancer-Aktivierung in einer Zelle beobachten können. Wenn ein Gen etwa zur gleichen Zeit wie ein bestimmter Enhancer aktiviert wird, deutet dies stark darauf hin, dass der Enhancer dieses Gen kontrolliert.

Wenn Forscher mehr darüber erfahren, welche Enhancer in verschiedenen Zelltypen welche Gene kontrollieren, können sie potenzielle Wirkstoffziele für genetische Erkrankungen identifizieren. Genomische Studien haben Mutationen in vielen nicht-proteinkodierenden Regionen identifiziert, die mit einer Reihe von Krankheiten in Verbindung stehen. Könnten dies unbekannte Enhancer sein?

„Wenn man mithilfe genetischer Technologien beginnt, Chromosomenbereiche zu identifizieren, die Krankheitsinformationen enthalten, entsprechen die meisten dieser Stellen keinen Genen. Wir vermuten, dass sie diesen Enhancern entsprechen, die ziemlich weit von einem Promotor entfernt sein können. Daher ist es sehr wichtig, diese Enhancer identifizieren zu können“, sagt Phillip Sharp, emeritierter Professor am MIT Institute und Mitglied des Koch Institute for Integrative Cancer Research des MIT.

Sharp ist der leitende Autor der neuen Studie. das erscheint In Natur. Der MIT-Forschungsassistent DB Jay Mahat ist der Hauptautor des Artikels.

Auf der Jagd nach eRNA

Weniger als 2 % des menschlichen Genoms bestehen aus proteinkodierenden Genen. Der Rest des Genoms enthält viele Elemente, die steuern, wann und wie diese Gene exprimiert werden. Enhancer, von denen man annimmt, dass sie Gene aktivieren, indem sie durch vorübergehende Bildung eines Komplexes in physischen Kontakt mit Genpromotorregionen kommen, wurden vor etwa 45 Jahren entdeckt.

Erst kürzlich, im Jahr 2010, entdeckten Forscher, dass diese Enhancer in RNA-Moleküle transkribiert werden, die als Enhancer-RNA oder eRNA bezeichnet werden. Wissenschaftler vermuten, dass diese Transkription stattfindet, wenn die Enhancer aktiv mit ihren Zielgenen interagieren. Dies eröffnete die Möglichkeit, dass die Messung der eRNA-Transkriptionsniveaus Forschern dabei helfen könnte, festzustellen, wann ein Enhancer aktiv ist und auf welche Gene er abzielt.

„Diese Informationen sind außerordentlich wichtig, um zu verstehen, wie die Entwicklung erfolgt und wie Krebserkrankungen ihre Regulationsprogramme ändern und Prozesse aktivieren, die zu Dedifferenzierung und metastatischem Wachstum führen“, sagt Mahat.

Diese Art der Kartierung hat sich jedoch als schwierig erwiesen, da eRNA in sehr geringen Mengen produziert wird und nicht lange in der Zelle verbleibt. Darüber hinaus fehlt eRNA eine Modifikation, die als Poly-A-Schwanz bekannt ist und den „Haken“ darstellt, den die meisten Techniken verwenden, um RNA aus einer Zelle zu ziehen.

Eine Möglichkeit, eRNA zu erfassen, besteht darin, Zellen ein Nukleotid hinzuzufügen, das die Transkription stoppt, wenn es in RNA eingebaut wird. Diese Nukleotide enthalten auch eine Markierung namens Biotin, mit der die RNA aus einer Zelle herausgefischt werden kann. Diese aktuelle Technik funktioniert jedoch nur bei großen Zellpools und liefert keine Informationen über einzelne Zellen.

Beim Brainstorming zu neuen Möglichkeiten der eRNA-Erfassung erwogen Mahat und Sharp den Einsatz der Klick-Chemie, einer Technik, mit der sich zwei Moleküle miteinander verbinden lassen, wenn sie jeweils mit „Klick-Griffen“ versehen sind, die miteinander reagieren können.

Die Forscher entwickelten Nukleotide, die mit einem Klick-Griff markiert waren. Sobald diese Nukleotide in wachsende eRNA-Stränge eingebaut sind, können die Stränge mit einem Etikett, das den komplementären Griff enthält, herausgefischt werden. Dies ermöglichte es den Forschern, eRNA einzufangen und sie dann zu reinigen, zu amplifizieren und zu sequenzieren. Bei jedem Schritt geht etwas RNA verloren, aber Mahat schätzt, dass sie erfolgreich etwa 10 % der eRNA aus einer bestimmten Zelle herausziehen können.

Mithilfe dieser Technik erhielten die Forscher eine Momentaufnahme der Enhancer und Gene, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in einer Zelle aktiv transkribiert werden.

„Man möchte in jeder Zelle die Aktivierung der Transkription von regulatorischen Elementen und dem entsprechenden Gen feststellen können. Und das muss in einer einzelnen Zelle geschehen, denn dort kann man Synchronizität oder Asynchronizität zwischen regulatorischen Elementen und Genen feststellen“, sagt Mahat.

Zeitpunkt der Genexpression

Die Forscher demonstrierten ihre Technik an embryonalen Stammzellen von Mäusen und stellten fest, dass sie anhand der Länge des RNA-Strangs und der Geschwindigkeit der Polymerase (des für die Transkription verantwortlichen Enzyms) ungefähr berechnen konnten, wann mit der Transkription einer bestimmten Region begonnen wird – also wie weit die Polymerase pro Sekunde transkribiert. So konnten sie feststellen, welche Gene und Enhancer ungefähr zur gleichen Zeit transkribiert wurden.

Mit diesem Ansatz konnten die Forscher den Zeitpunkt der Expression von Zellzyklusgenen detaillierter bestimmen, als dies bisher möglich war. Sie konnten außerdem mehrere Sätze bekannter Gen-Enhancer-Paare bestätigen und eine Liste von etwa 50.000 möglichen Enhancer-Gen-Paaren erstellen, die sie nun zu verifizieren versuchen können.

Zu wissen, welche Enhancer welche Gene kontrollieren, könnte sich als wertvoll erweisen, wenn es darum geht, neue Behandlungsmethoden für Krankheiten zu entwickeln, die auf genetischer Grundlage beruhen. Im vergangenen Jahr genehmigte die US-amerikanische Food and Drug Administration die erste Gentherapie gegen Sichelzellenanämie. Sie funktioniert durch die Störung eines Enhancers, der zur Aktivierung eines fetalen Globin-Gens führt und so die Produktion von Sichelzellen reduziert.

Das MIT-Team wendet diesen Ansatz nun auf andere Zelltypen an, wobei der Schwerpunkt auf Autoimmunerkrankungen liegt. In Zusammenarbeit mit Forschern des Boston Children’s Hospital untersuchen sie Immunzellmutationen, die mit Lupus in Verbindung gebracht wurden und von denen viele in nicht-kodierenden Regionen des Genoms gefunden werden.

„Es ist nicht klar, welche Gene von diesen Mutationen betroffen sind, also beginnen wir, die Gene auseinanderzuhalten, die diese mutmaßlichen Enhancer möglicherweise regulieren, und herauszufinden, in welchen Zelltypen diese Enhancer aktiv sind“, sagt Mahat. „Dies ist ein Werkzeug zur Erstellung von Gen-Enhancer-Karten, die für das Verständnis der Biologie von grundlegender Bedeutung sind und auch eine Grundlage für das Verständnis von Krankheiten bilden.“

Die Erkenntnisse dieser Studie liefern auch Beweise für eine Theorie, die Sharp kürzlich zusammen mit den MIT-Professoren Richard Young und Arup Chakraborty entwickelt hat: Danach wird die Gentranskription durch membranlose Tröpfchen, sogenannte Kondensate, gesteuert.

Diese Kondensate bestehen aus großen Clustern von Enzymen und RNA, zu denen laut Sharp auch an Enhancer-Stellen produzierte eRNA gehören könnte.

„Wir stellen uns vor, dass die Kommunikation zwischen einem Enhancer und einem Promotor eine kondensatartige, vorübergehende Struktur ist, und RNA ist ein Teil davon. Dies ist ein wichtiger Teil der Arbeit zum Verständnis, wie RNAs von Enhancern aktiv sein könnten“, sagt er.

Diese Geschichte wird mit freundlicher Genehmigung von MIT News erneut veröffentlicht (web.mit.edu/newsoffice/), eine beliebte Site mit Neuigkeiten zu Forschung, Innovation und Lehre am MIT.