Konstruktion von „On-Gel“-Alveolarorganoiden als neue Screening-Plattform

Eine von Professor Shimpei Gotoh (Abteilung für klinische Anwendung) geleitete Studie stellt eine neue Kultivierungsmethode zur Erzeugung alveolärer Organoide vor, die für das Screening mit mittlerem und hohem Durchsatz geeignet sind, und identifizierte mehrere Chemikalien mit synergistischen Wirkungen auf die AT1-Zelldifferenzierung. Die Arbeit ist veröffentlicht im Tagebuch Stammzellberichte.

Alveolen, die funktionellen Einheiten der Lunge, in denen der Gasaustausch stattfindet, bestehen hauptsächlich aus alveolären Epithelzellen vom Typ 1 und 2 (AT1- bzw. AT2-Zellen). AT2-Zellen produzieren nicht nur Lungensurfactants, sondern sind quaderförmige Gewebestammzellen, die die alveoläre Homöostase aufrechterhalten und Regenerationsprozesse nach Verletzungen durch Selbsterneuerung und Differenzierung in AT1-Zellen regulieren.

Im Gegensatz dazu sind AT1-Zellen dünne und flache Zellen, die den größten Teil der Alveolaroberfläche ausmachen und den Austausch von Sauerstoff und Kohlendioxid vermitteln. Das derzeitige Wissen über die Signalmechanismen, die der AT1-Differenzierung von AT2-Zellen zugrunde liegen, basiert hauptsächlich auf Studien an Mäusen, und es bleibt unklar, ob es Artenunterschiede im Regulierungsprozess gibt.

Darüber hinaus wurden in Studien traditionellerweise menschliche primäre AT2-Zellen eingesetzt, deren begrenzte Verfügbarkeit hat jedoch den Fortschritt in diesem Forschungsbereich behindert. Alternativ stellen menschliche iPS-Zellen ein wertvolles Ausgangsmaterial für die Untersuchung der Differenzierung alveolarer Epithelzellen dar.

Das Gotoh-Labor hatte zuvor Induktionsprotokolle zur Erzeugung von AT2-Zellen aus iPS-Zellen und zur Herstellung von Alveolarorganoiden aus von Patienten stammenden iPS-Zellen zur Krankheitsmodellierung erstellt. Allerdings sind solche Organoide für Screening-Verfahren nicht optimal, da sie eine große Zellzahl erfordern und vollständig in Matrigel eingebettet sind, einem Zellkultursubstrat, das der extrazellulären Umgebung ähnelt.

In der vorliegenden Studie entwickelten die Forscher eine neuartige duale Reporter-iPS-Zelllinie zur Überwachung der AT1-Zelldifferenzierung und leiteten eine neue „On-Gel“-Methode zur Kultivierung von Alveolarorganoiden ab, indem sie 96 aus iPS-Zellen stammende Lungenvorläufer- oder AT2-Zellen auf Matrigel aussäten -Well-Platten.

Während andere AT2-Marker mit dieser Methode eine ähnliche Expression zeigten, exprimierten AT2-Zellen in den resultierenden Sphäroiden deutlich höhere Mengen an Surfactant-Protein C als alveoläre Organoide, die mit zuvor etablierten Protokollen erzeugt wurden. Im Gegensatz dazu wurden in den „On-Gel“-Sphäroiden mehrere AT1-Zellmarker in geringeren Mengen nachgewiesen, was auf deren Abwesenheit oder Unreife hindeutet.

Obwohl für AT1-Zellmarker positive Zellen nachgewiesen wurden, bestätigten transkriptomische Analysen eine stärker AT2-dominante Zusammensetzung dieser „On-Gel“-Sphäroide. Darüber hinaus zeigten sphäroide AT2-Zellen strukturelle Merkmale, die an funktionelle AT2-Zellen erinnern.

Insgesamt deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass die neue „On-Gel“-Kulturmethode, die eine geringe Anzahl von Zellen zur Erzeugung und eine einfachere Handhabung erfordert, optimal für Screening-Verfahren zur Identifizierung potenzieller Induktoren der AT1-Differenzierung geeignet ist.

Als Beweis des Prinzips führte das Forschungsteam ein chemisches Screening mit mittlerem Durchsatz mit 274 Verbindungen unter Verwendung von Lungenvorläuferzellen durch, die mit der neu entwickelten „On-Gel“-Methode gezüchtet wurden, und stellte fest, dass 15 Chemikalien die Konzentrationen der AT1-Zellen deutlich erhöht hatten -spezifischer Reporter.

Als nächstes validierten sie diese Kandidatenverbindungen, indem sie ihre Fähigkeit untersuchten, die Expression der zellspezifischen AT1-Gene AGER, CLIC5 und CAV1 zu steigern.

Unter ihnen führten LATS-IN-1 und ROCK-IN-2, bekannt als Inhibitoren von LATS1/2 bzw. ROCK2, zu einer signifikanten Erhöhung dieser AT1-Markergene. Zusätzlich zu der Feststellung, dass die LATS1/2-Hemmung die AT1-Differenzierung durch Aktivierung der YAP/TAZ-Signalisierung förderte, stellten die Forscher auch fest, dass ROCK-IN-2 die YAP/TAZ-bezogene Genexpression induziert. Allerdings verklumpten beide Kandidatenverbindungen die Sphäroide und förderten die Proliferation, Eigenschaften, die denen von AT1-Zellen (d. h. flache und dünne ruhende Zellen) entgegengesetzt sind.

Sie testeten auch andere ROCK2-Inhibitoren, die die AT1-Differenzierung nicht förderten, was darauf hindeutet, dass die Fähigkeit von ROCK-IN-2, die AT1-Differenzierung zu induzieren, wahrscheinlich auf einen Off-Target-Effekt auf den YAP/TAZ-Signalweg zurückzuführen ist.

Vier weitere Kandidatenverbindungen zeigten intermediäre Wirkungen auf die Expression des AT1-Markergens und wurden daher auf synergistische Wirkungen in Kombination mit LATS-IN-1 zur Aktivierung der YAP/TAZ-Signalisierung getestet. Bemerkenswert ist, dass BAY1125976, ein allosterischer AKT-Inhibitor, in Kombination mit LATS-IN-1 die AT1-Genexpression synergistisch steigerte.

Während der Validierung beobachteten die Forscher auch synergistische Effekte zwischen LATS-IN-1 und zwei anderen PI3K/AKT-Inhibitoren, Alpelisib und AZD6482.

Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn eine unabhängige menschliche iPS-Zelllinie oder primäre AT2-Zellen mit derselben chemischen Kombination behandelt wurden. Durch zusätzliche transkriptomische, morphologische und funktionelle Analysen stellten die Forscher durchweg fest, dass die gleichzeitige Behandlung von LATS-IN-1 und BAY1125976 zelluläre Veränderungen in Richtung eines AT1-zellähnlichen Phänotyps fördert.

Durch die Generierung einer neuen Dual-Reporter-iPS-Zelllinie zur Überwachung der AT1-Differenzierung und die Etablierung der neuartigen „On-Gel“-Sphäroidkulturmethode, die mit Hochdurchsatz-Screening kompatibel ist, hat diese aktuelle Arbeit chemische Modulatoren der YAP/TAZ- und AKT-Signalwege als wirksam identifiziert Induktormischung für die AT1-Zelldifferenzierung.

Mit der Möglichkeit, „On-Gel“-Sphäroidkulturen für chemische Hochdurchsatz- oder CRISPR/Cas-basierte genetische Screenings anzupassen, werden die in dieser Studie entwickelten Innovationen dazu beitragen, die nächsten Durchbrüche in der regenerativen Lungenmedizin voranzutreiben.