Aufdeckung des Zyklisierungsmechanismus der zyklischen β-1,2-Glucan-Synthase

Das Polysaccharid β-1,2-Glucan besteht aus sich wiederholenden Glucoseeinheiten, die durch β-1,2-glykosidische Bindungen miteinander verbunden sind. Zyklische β-1,2-Glucane (CβGs) kommen in verschiedenen Bakterienarten vor und spielen eine Rolle bei bakteriellen Infektionen und symbiotischen Beziehungen. Die CβG-Biosynthese wird durch die zyklische β-1,2-Glucan-Synthase (CGS) katalysiert, ein Enzym, das die Cyclisierung (Bildung eines geschlossenen Rings) von linearem β-1,2-Glucan (LβG) katalysiert.

Da die Methode zur enzymatischen Synthese von linearem β-1,2-Glucan im großen Maßstab bereits etabliert ist, ist die Kombination mit diesem Enzym für eine effiziente Eintopfsynthese von zyklischem β-1,2-Glucan technisch machbar. Allerdings ist die cyclisierende Aktivität dieses Enzyms nicht sehr stark und es weist auch eine geringe Stabilität als Enzym auf.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Bindung von Glucose an CGS, die Verlängerung der LβG-Ketten, die Anpassung der Glucankettenlänge und die Zyklisierung der Glucane über drei verschiedene Domänen von CGS verteilt sind. Obwohl bekannt ist, dass die Enzymdomäne in der mittleren Region von CGS LβGs zyklisiert, ist ein detaillierter Mechanismus für diesen Prozess den Wissenschaftlern bislang unbekannt.

Kürzlich hat ein Forscherteam aus Japan den katalytischen Mechanismus der CGS-Zyklisierung durch Funktions- und Strukturanalysen der CGS-Zyklisierungsdomäne des Bakteriums Thermoanaerobacter italicus (TiCGSCy) aufgedeckt. Das Team wurde von Assistenzprofessor Nobukiyo Tanaka vom Department of Applied Biological Science der Tokyo University of Science (TUS) geleitet und umfasste Br. Ryotaro Saito, außerordentlicher Professor Masahiro Nakajima und außerordentlicher Professor Tomoko Masaike, alle von TUS, sowie außerordentlicher Professor Hiroyuki Nakai von der Niigata-Universität und Dr. Kaito Kobayashi vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST).

Ihre Ergebnisse wurden in der Zeitschrift veröffentlicht Angewandte Mikrobiologie und Biotechnologie.

Dr. Tanaka führt aus: „CGSs sind aus physiologischer Sicht wichtige Enzyme, da CβGs an verschiedenen bakteriellen Erkrankungen und symbiotischen Beziehungen beteiligt sind. Wir wollten gerne Einblicke in die Struktur und Funktion von CGSs geben, die zwar in der Forschung Beachtung finden, für die sie aber nicht geeignet sind.“ Der Mechanismus der β-1,2-Glucan-Zyklisierung bleibt ein Rätsel.“

Der erste Schritt der Forschung bestand darin, die alleinige Cyclisierungsdomäne, TiCGSCy, als rekombinantes Enzym in Escherichia coli zu exprimieren.

Der nächste Schritt zur Charakterisierung umfasste die Analyse von Reaktionsprodukten, wenn LβGs als Substrat für TiCGSCy verwendet wurden. „Wir entdeckten, dass TiCGSCy β-Glucosidase-resistente Verbindungen produzierte. Bei der Untersuchung mittels Kernspinresonanzspektroskopie fanden wir CβGs. Dies war der erste Beweis dafür, dass TiCGSCy CβGs produzierte“, erklärt Dr. Tanaka.

Um die Wirkungsmuster von TiCGSCy auf LβGs zu bestimmen, behandelte das Team TiCGSCy mit β-1,2-Gluoligosacchariden (LβGs, die 2–10 Glucoseeinheiten umfassen) und analysierte die Produkte. Die Reaktionsprodukte zeigten, dass dem TiCGSCy-Mechanismus eine Hydrolysereaktion fehlte, er eine Transglykosylierung aufwies und Substrate mit einer Länge von mindestens Hexasacchariden (Polymere mit sechs oder mehr Glucoseeinheiten) erforderte.

Dieser Befund stimmte mit Daten früherer Studien überein, in denen verwandte CGSs CβGs mit Polymeren von etwa 20 Glucoseeinheiten produzierten. Schließlich wurde vermutet, dass TiCGSCy über einen Anomer-erhaltenden Mechanismus verfügt, da es ein Produkt mit demselben Anomer wie sein Substrat erzeugt.

Darüber hinaus zeigte die Strukturanalyse von TiCGSCy mittels Röntgenkristallographie, dass TiCGSCy, die β-1,2-Glucanasen aus Chitinophaga pinensis (CpSGL, zu GH144 gehörend) und dem Pilz Talaromyces funiculosus (TfSGL, zu GH162 gehörend) jedoch strukturell ähnlich sind Ihre Aminosäuresequenzhomologie ist sehr gering.

Die komplexe Struktur von CpSGL (GH144), die Michaelis-Komplexstruktur von TfSGL (GH162) und die Gesamtstruktur von TiCGSCy wurden überlagert, um die katalytischen Reste von TiCGSCy zu untersuchen.

Als Ergebnis wurde festgestellt, dass E1356 in der Lage war, über die 3-OH-Gruppe des Glucosemoleküls an der Unterstelle +2 auf das Sauerstoffatom der glykosidischen Bindung an der Spaltungsstelle einzuwirken, und E1442 war so positioniert, dass es direkt a ausführte Nukleophiler Angriff auf das anomere Zentrum der Unterstelle –1. Folglich wurde gefolgert, dass sie die allgemeine Säure/Base bzw. der nukleophile Rest für die Katalyse sind.

Der detaillierte Reaktionsmechanismus von TiCGSCy ist wie folgt:

Bei der oben erwähnten Reaktion wurde vermutet, dass ein lineares Produkt erhalten wird, wenn die Hydroxylgruppe eines anderen Moleküls als dem, das das Glykosyl-Enzym-Zwischenprodukt bildet, das anomere Kohlenstoffatom in (a) angreift. Wenn umgekehrt die angreifende Hydroxylgruppe aus demselben Molekül stammt, entsteht ein zyklisches Produkt.

Insgesamt haben diese Ergebnisse erhebliche Auswirkungen auf die Charakterisierung von TiCGSCy. „Angesichts seines nichtkanonischen Reaktionsmechanismus definiert dieses CGS eine neue Familie von Glykosidhydrolasen, GH189“, sagt Dr. Tanaka.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Forscher durch diese Forschung Reste identifiziert haben, die für die zyklisierende Aktivität wichtig sind, was zur gewünschten Suche nach Enzymen mit stärkerer zyklisierender Aktivität und höherer Stabilität führt. Das Team ist zuversichtlich, dass ihre Arbeit Forschungswege zur Erforschung der Hemmung von CGS eröffnen wird.