Die kürzliche Zulassung einer CRISPR-Cas9-Therapie für Sichelzellanämie zeigt, dass Gen-Editing-Tools hervorragende Arbeit leisten können, um Gene auszuschalten, um Erbkrankheiten zu heilen. Aber es ist immer noch nicht möglich, ganze Gene in das menschliche Genom einzubauen, um defekte oder schädliche Gene zu ersetzen.
Eine neue Technik, die ein Retrotransposon von Vögeln nutzt, um Gene in das Genom einzufügen, ist für die Gentherapie vielversprechender, da sie Gene in einen „sicheren Hafen“ im menschlichen Genom einfügt, wo die Einfügung keine essentiellen Gene stört oder zu Krebs führt.
Retrotransposons oder Retroelemente sind DNA-Stücke, die, wenn sie in RNA transkribiert werden, für Enzyme kodieren, die RNA im Genom zurück in DNA kopieren – ein eigennütziger Zyklus, der das Genom mit Retrotransposon-DNA überfüllt. Etwa 40 % des menschlichen Genoms bestehen aus dieser „egoistischen“ neuen DNA, obwohl die meisten Gene deaktiviert sind, sogenannte Junk-DNA.
Die neue Technik namens Precise RNA-mediated INsertion of Transgenes (PRINT) nutzt die Fähigkeit einiger Retrotransposons, ganze Gene effizient in das Genom einzufügen, ohne andere Genomfunktionen zu beeinträchtigen. PRINT würde die anerkannte Fähigkeit der CRISPR-Cas-Technologie ergänzen, Gene zu deaktivieren, Punktmutationen vorzunehmen und kurze DNA-Segmente einzufügen.
Eine Beschreibung von PRINT, das im Labor von Kathleen Collins, Professorin für Molekular- und Zellbiologie an der University of California, Berkeley, entwickelt wurde, wird am 20. Februar in der Zeitschrift veröffentlicht Naturbiotechnologie.
Bei PRINT wird neue DNA in eine Zelle eingefügt, und zwar mithilfe von Verabreichungsmethoden, die denen ähneln, mit denen CRISPR-Cas9 zur Genombearbeitung in Zellen transportiert wird. Für PRINT kodiert ein Stück der zugeführten RNA ein gängiges Retroelement-Protein namens R2-Protein, das über mehrere aktive Teile verfügt, darunter eine Nickase – ein Enzym, das doppelsträngige DNA bindet und schneidet – und Reverse Transkriptase, das Enzym, das die DNA-Kopie davon erzeugt RNA. Die andere RNA ist die Vorlage für die einzufügende Transgen-DNA sowie Elemente zur Steuerung der Genexpression – eine vollständige autonome Transgenkassette, die das R2-Protein in das Genom einfügt, sagte Collins.
Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung des R2-Proteins besteht darin, dass das Transgen in einen Bereich des Genoms eingefügt wird, der Hunderte identischer Kopien desselben Gens enthält – von denen jede für ribosomale RNA kodiert, die RNA-Maschine, die Boten-RNA (mRNA) in Protein übersetzt. Bei so vielen redundanten Kopien wird der Verlust der Gene nicht übersehen, wenn die Insertion ein oder mehrere ribosomale RNA-Gene zerstört.
Indem das Transgen in einen sicheren Hafen gebracht wird, wird ein großes Problem vermieden, das beim Einfügen von Transgenen über einen menschlichen Virusvektor auftritt, was heute die gängige Methode ist: Das Gen wird oft zufällig in das Genom eingefügt, wodurch funktionierende Gene deaktiviert oder die Regulierung oder Funktion von Genen beeinträchtigt wird , was möglicherweise zu Krebs führen kann.
„Ein CRISPR-Cas9-basierter Ansatz kann ein mutiertes Nukleotid reparieren oder einen kleinen DNA-Abschnitt einfügen – eine Sequenzfixierung. Oder Sie können einfach eine Genfunktion durch ortsspezifische Mutagenese ausschalten“, sagte Collins, Inhaberin der Walter- und Ruth-Schubert-Stiftung Familienstuhl.
„Wir schalten keine Genfunktion aus. Wir reparieren keine endogene Genmutation. Wir verfolgen einen komplementären Ansatz, der darin besteht, ein autonom exprimiertes Gen in das Genom einzubauen, das ein aktives Protein erzeugt – um ein wieder hinzuzufügen.“ funktionelles Gen als Defizit-Bypass. Es handelt sich um eine Transgenergänzung anstelle einer Mutationsumkehr. Um Funktionsverlustkrankheiten zu beheben, die aus einer Vielzahl einzelner Mutationen desselben Gens resultieren, ist das großartig.“
„Die wahren Gewinner kamen von den Vögeln“
Viele Erbkrankheiten wie Mukoviszidose und Hämophilie werden durch eine Reihe verschiedener Mutationen im selben Gen verursacht, die alle die Funktion des Gens beeinträchtigen. Jede CRISPR-Cas9-basierte Gen-Editing-Therapie müsste auf die spezifische Mutation einer Person zugeschnitten sein. Eine Genergänzung mit PRINT könnte stattdessen jedem Menschen mit der Krankheit das richtige Gen liefern, sodass der Körper jedes Patienten das normale Protein herstellen kann, unabhängig von der ursprünglichen Mutation.
Viele akademische Labore und Startups untersuchen die Verwendung von Transposons und Retrotransposons zum Einfügen von Genen für die Gentherapie. Ein beliebtes Retrotransposon, das von Biotech-Unternehmen untersucht wird, ist LINE-1 (Long INterspersed Element-1), das sich beim Menschen und einige Anhalter-Gene dupliziert hat, um etwa 30 % des Genoms abzudecken, jedoch weniger als 100 der LINE-1-Retrotransposonen unseres Genoms Kopien sind heute funktionsfähig, ein winziger Bruchteil des Genoms.
Collins, zusammen mit der UC Berkeley-Postdoktorandin Akanksha Thawani und Eva Nogales, UC Berkeley Distinguished Professor in der Abteilung für Molekular- und Zellbiologie und Forscherin am Howard Hughes Medical Institute, veröffentlicht eine kryoelektronenmikroskopische Struktur des Enzymproteins, das vom LINE-1-Retroelement kodiert wird, am 14. Dezember in der Zeitschrift Natur.
Diese Studie habe deutlich gemacht, sagte Collins, dass das LINE-1-Retrotransposon-Protein schwer zu manipulieren sei, um ein Transgen sicher und effizient in das menschliche Genom einzufügen. Aber frühere Untersuchungen, die zeigen, dass Gene, die in die repetitive, ribosomale RNA-kodierende Region des Genoms (die rDNA) eingefügt werden, normal exprimiert werden, legten Collins nahe, dass ein anderes Retroelement namens R2 möglicherweise besser für die sichere Transgeninsertion geeignet ist.
Da R2 beim Menschen nicht vorkommt, untersuchten Collins und die leitende Forscherin Xiaozhu Zhang sowie die Postdoktorandin Briana Van Treeck, beide von der UC Berkeley, R2 in mehr als zwanzig Tiergenomen, von Insekten bis zum Pfeilschwanzkrebs und anderen mehrzelligen Eukaryoten, um R2 zu finden eine Version, die stark auf rDNA-Regionen im menschlichen Genom ausgerichtet war und große DNA-Längen effizient in die Region einfügen konnte.
„Nachdem wir Dutzende von ihnen gejagt hatten, waren die wahren Gewinner die Vögel“, sagte Collins, darunter der Zebrafink und der Weißkehlsperling.
Während Säugetiere kein R2 in ihren Genomen haben, verfügen sie über die Bindungsstellen, die R2 benötigt, um effektiv als Retroelement eingefügt zu werden – wahrscheinlich ein Zeichen dafür, sagte sie, dass die Vorgänger der Säugetiere ein R2-ähnliches Retroelement hatten, das irgendwie herausgeworfen wurde das Säugetiergenom.
In Experimenten synthetisierten Zhang und Van Treeck das mRNA-kodierende R2-Protein und eine Matrizen-RNA, die ein Transgen mit einem fluoreszierenden Protein erzeugen würde, das von einem RNA-Polymerase-Promotor exprimiert wird. Diese wurden in kultivierte menschliche Zellen cotransfiziert. Etwa die Hälfte der Zellen leuchteten aufgrund der Expression fluoreszierender Proteine unter Laserlicht grün oder rot auf, was zeigt, dass das R2-System erfolgreich ein funktionierendes fluoreszierendes Protein in das Genom eingefügt hatte.
Weitere Studien zeigten, dass das Transgen tatsächlich in die rDNA-Regionen des Genoms eingefügt wurde und dass etwa 10 Kopien der RNA-Matrize eingefügt werden konnten, ohne die Proteinherstellungsaktivität der rDNA-Gene zu stören.
Ein riesiges Ribosomen-Biogenesezentrum
Das Einfügen von Transgenen in rDNA-Regionen des Genoms ist aus anderen Gründen vorteilhaft, als dass es ihnen einen sicheren Hafen bietet. Die rDNA-Regionen befinden sich auf den kurzen Armen von fünf separaten Chromosomen. Alle diese kurzen Arme drängen sich zusammen und bilden eine Struktur namens Nukleolus, in der DNA in ribosomale RNA umgeschrieben wird, die sich dann in die ribosomale Maschinerie faltet, die Proteine herstellt.
Im Nukleolus ist die rDNA-Transkription stark reguliert und die Gene werden schnell repariert, da jegliche rDNA-Brüche, wenn sie sich weiter ausbreiten, die Proteinproduktion zum Erliegen bringen könnten. Infolgedessen würde jedes in die rDNA-Region des Genoms eingefügte Transgen im Nukleolus mit Samthandschuhen angefasst.
„Der Nukleolus ist ein riesiges Ribosomen-Biogenesezentrum“, sagte Collins. „Aber es ist auch eine wirklich privilegierte DNA-Reparaturumgebung mit geringem onkogenen Risiko durch Geninsertion. Es ist großartig, dass diese erfolgreichen Retroelemente – ich vermenschliche sie – in die ribosomale DNA gelangt sind. Sie liegt in mehreren Kopien vor, ist konserviert und ein sicherer Hafen.“ das Gefühl, dass man eine dieser Kopien zerstören kann und es der Zelle egal ist.“
Dies macht die Region zu einem idealen Ort, um ein Gen für die Gentherapie beim Menschen einzufügen.
Collins gab zu, dass noch viel Unbekanntes über die Funktionsweise von R2 vorliegt und dass Fragen zur Biologie der rDNA-Transkription offen bleiben: Wie viele rDNA-Gene können gestört werden, bevor die Zelle sich darum kümmert? Sind diese Zellen anfälliger für Nebenwirkungen von PRINT, da einige Zellen viele der über 400 rDNA-Gene im menschlichen Genom ausschalten?
Sie und ihr Team untersuchen diese Fragen, optimieren aber auch die verschiedenen Proteine und RNAs, die an der Retroelement-Insertion beteiligt sind, damit PRINT in kultivierten Zellen und Primärzellen aus menschlichem Gewebe besser funktioniert.
Das Fazit sei jedoch: „Es funktioniert“, sagte sie. „Es ist nur so, dass wir ein bisschen mehr über die Biologie unserer rDNA verstehen müssen, um sie wirklich nutzen zu können.“
Mehr Informationen:
Nutzung eukaryotischer Retroelementproteine für die Transgeninsertion in humane Safe-Harbor-Loci, Naturbiotechnologie (2024). DOI: 10.1038/s41587-024-02137-y
Akanksha Thawani et al., Template- und Zielstellenerkennung durch menschliches LINE-1 in Retrotransposition, Natur (2023). DOI: 10.1038/s41586-023-06933-5.