Wissenschaftler stellen COVID-Rezeptorprotein in Mauszellen her

Ein Team von Wissenschaftlern am Brookhaven National Laboratory des US-Energieministeriums (DOE) und der Columbia University hat einen Weg aufgezeigt, große Mengen des Rezeptors zu produzieren, an den SARS-CoV-2, das Virus, das COVID-19 verursacht, auf der Oberfläche bindet von menschlichen Zellen. Diese Bindung zwischen dem mittlerweile berüchtigten viralen Spike-Protein und dem menschlichen „ACE2“-Rezeptor ist der erste Schritt der Infektion durch das Virus. Die Herstellung funktionellen menschlichen ACE2-Proteins in Mauszellen bietet Wissenschaftlern eine neue Möglichkeit, diese Rezeptoren zu untersuchen und sie möglicherweise zu nutzen. Darüber hinaus, wie in einem gerade in der Zeitschrift veröffentlichten Artikel beschrieben Virologiekönnte die Methode die Untersuchung anderer komplexer Proteine ​​erleichtern, die sich auf andere Weise nur schwer herstellen lassen.

Das ursprüngliche Ziel der Brookhaven-Wissenschaftler bestand zu Beginn der Pandemie darin, große Mengen menschlichen ACE2 herzustellen und das Protein dann an Nanopartikel zu binden. Die ACE2-beschichteten Nanopartikel könnten dann als antivirale Therapeutika und/oder als Sensoren zum Nachweis von Viruspartikeln getestet werden.

„Für jede dieser Anwendungen benötigt man große Mengen an Protein, und das Protein muss voll funktionsfähig sein“, sagte der Virologe Paul Freimuth vom Brookhaven Lab, der die Forschung in Zusammenarbeit mit Wissenschaftlern am Center for Functional Nanomaterials (CFN) des Brookhaven Lab leitete. „Die Herstellung funktioneller Membranproteine ​​wie ACE2 ist jedoch eine besondere Herausforderung, da der Prozess, durch den Proteine ​​​​in der Zellmembran lokalisiert werden, komplex ist.“

Ein Grund dafür ist, dass diese Proteine ​​nach ihrer Synthese und vor dem Einbau in die Zellmembran auf verschiedene Weise verändert werden. Insbesondere den Proteinen hinzugefügte Kohlenhydratmoleküle spielen eine Schlüsselrolle sowohl bei der Faltung der langen Proteinkette in ihre endgültige 3D-Struktur als auch bei der Funktion des Proteins in der Membran.

„Kohlenhydrate machen etwa ein Drittel der Masse des ACE2-Proteins aus“, sagte Freimuth.

Den einfachsten Zellen, die Wissenschaftler zur künstlichen Erzeugung von Proteinen verwenden, nämlich Bakterien, fehlen die Enzyme, um diese Kohlenhydratzusätze anzuheften. Deshalb wandte sich das Brookhaven-Team Zellen von Mäusen zu, die als Säugetiere uns ähnlicher sind – und daher in der Lage sind, die gleiche Art der Kohlenhydratverarbeitung durchzuführen. Es ist bekannt, dass Mauszellen in der Lage sind, „fremde“ Gene aufzunehmen und auszudrücken. Und während Mauszellen auch einen ACE2-Rezeptor bilden, bindet die Mausversion des Proteins nicht an den SARS-CoV-2-Spike. Das bedeutet, dass die Wissenschaftler auf einfache Weise feststellen könnten, ob die Mauszellen das menschliche ACE2-Protein herstellen – indem sie prüfen, ob sich die Spikes an die Zellen binden würden.

Finden und Ausdrücken des ACE2-Gens

Um die Chancen zu erhöhen, dass Mauszellen das menschliche ACE2-Gen korrekt einbauen und lesen, verwendete die Gruppe das intakte Gen. Gene von Menschen und anderen „höheren Organismen“ enthalten neben der DNA-Sequenz, die für die Aminosäurebausteine ​​kodiert, aus denen ein Protein besteht, viele Informationen. Diese zusätzlichen Informationen helfen bei der Regulierung der Genstruktur und -funktion innerhalb der Chromosomen der Zelle.

Die Wissenschaftler durchsuchten Bibliotheken geklonter DNA-Fragmente, die im Rahmen der Studie erzeugt wurden Humangenomprojekt– ein vom DOE gefördertes Projekt zur Kartierung der Standorte aller Gene, die uns zum Menschen machen – um ein Fragment zu finden, das das intakte ACE2-Gen samt seinen eingebetteten regulatorischen Informationen enthielt. Anschließend setzten sie Mauszellen Nanopartikeln aus, die mit diesem DNA-Fragment und dem Gen für ein weiteres Protein beschichtet waren, das Zellen resistent gegen ein tödliches Antibiotikum macht.

„In diesem Fall dienen die Nanopartikel als DNA-Transportmittel, das von den Zellen aufgenommen wird, sodass die DNA möglicherweise in die Chromosomen der Mauszellen integriert werden kann“, sagte Freimuth. „Um die Zellen zu finden, die das/die fremde(n) Gen(e) aufgenommen haben, geben wir das Antibiotikum zu den Zellkulturen. Zellen, die das Antibiotikaresistenzgen nicht aufnehmen und exprimieren konnten, starben, während diejenigen, die eine Antibiotikaresistenz entwickelten, überlebten und zu Kolonien heranwuchsen .“

Die Wissenschaftler erweiterten etwa 50 dieser Kolonien zu einzelnen Kulturen und testeten sie dann, um festzustellen, wie viele auch das menschliche ACE2-Gen aufgenommen und das menschliche Rezeptorprotein produziert hatten.

Nachweis der Proteinproduktion

„Etwa 70 % der antibiotikaresistenten Kolonien exprimierten das menschliche ACE2-Protein auf der Zelloberfläche“, sagte Freimuth. „Weitere Analysen ergaben, dass diese Kolonien im Durchschnitt 28 Kopien des menschlichen ACE2-Gens enthielten.“

Wichtig ist, dass die Mauszellen die Kopien des „fremden“ ACE2-Gens behielten und über mindestens 90 Zellgenerationen hinweg weiterhin das von diesen Genen kodierte menschliche ACE2-Protein produzierten.

Die Menge des von den Zellen produzierten menschlichen ACE2-Proteins war im Allgemeinen proportional zur Anzahl der in das Mausgenom integrierten ACE2-Genkopien. Mehrere der Mauszellklone produzierten etwa 50-mal mehr ACE2, als normalerweise auf Mauszellen vorhanden ist.

Die Wissenschaftler verwendeten verschiedene Methoden, um zu testen, ob die von der Maus hergestellten menschlichen ACE2-Proteine ​​funktionsfähig waren. Dazu gehörte der Nachweis, dass ein „Pseudovirus“, das das COVID-Spike-Protein – also einen nicht pathogenen Ersatz für SARS-CoV-2 – enthält, an die Rezeptoren binden und die Zellen infizieren kann.

„Diese Infektiositätstests zeigten, dass das auf diesen Mauszellen exprimierte menschliche ACE2-Protein voll funktionsfähig ist“, sagte Freimuth.

Verwendungen und Auswirkungen

Unterdessen untersuchten Oleg Gang und Feiyue Teng, Co-Autoren der Studie von CFN, verschiedene Möglichkeiten, extrazelluläre Nanovesikel zu erzeugen, die mit menschlichem ACE2 als Lockmittel angereichert sind, für die mögliche Behandlung von COVID-19. Sie untersuchen auch die Platzierung von ACE2-Proteinen auf Nanopartikeln für mögliche Anwendungen bei der Infektionsbehandlung oder der schnellen Viruserkennung.

„Die Herausforderung von ACE2-basierten Nanovesikeln besteht darin, ihre Neutralisierungswirkung gegen SARS-CoV-2 zu verstärken. Wir suchen auch nach Möglichkeiten, die Bindungsempfindlichkeit und Spezifität von ACE2-gekoppelten Nanopartikeln zu verbessern und zu nutzen, um sie für Viren nützlich zu machen.“ Diagnostik. Beide Ansätze würden zukünftige Optimierungsbemühungen erfordern“, sagte Teng, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter am CFN, der sich intensiv mit den biologischen Aspekten dieser Studie und den möglichen nanowissenschaftlichen Anwendungen beschäftigte.

„Wir freuen uns, Fortschritte in der Herstellung von Nanomaterialien mit biomolekularen Ansätzen zur Entwicklung neuer Therapie- und Sensorstrategien zu kombinieren“, sagte Gang, der eine gemeinsame Anstellung an der Columbia University innehat. „Mit dieser Studie konnten wir einige methodische Probleme überwinden, da Nanomaterialien und Biosysteme ganz unterschiedliche Charakterisierungsansätze erforderten. Was wir hier gelernt haben, ist wichtig für unsere nächsten Schritte zur Verbesserung der nanopartikelbasierten Biosensorik.“

Die Arbeit ermöglicht nicht nur mögliche Anwendungen des rekombinanten ACE2-Proteins, sondern zeigt auch einen neuartigen Ansatz zur Herstellung einer breiten Palette komplexer Proteine ​​auf. Beispiele hierfür sind die große Vielfalt an Zelloberflächenrezeptoren, die unzählige biologische Prozesse und Krankheitsprozesse vermitteln, sowie industriell wichtige Proteine ​​wie monoklonale Antikörper und Enzyme.

„Unsere Methode, intakte Gene zusammen mit Mauszellen zu verwenden, die an das Wachstum in riesigen Suspensionskulturen angepasst werden können – ähnlich wie die flüssigen Brühenkulturen, die zum Züchten von Bakterien verwendet werden – könnte die Produktion dieser und anderer wichtiger Proteine ​​im großen Maßstab vorantreiben“, sagte Freimuth .