Wissenschaftler des Wake Forest Institute for Regenerative Medicine (WFIRM), die an der CRISPR/Cas9-vermittelten Gen-Editierungstechnologie arbeiten, haben eine Methode entwickelt, um die Effizienz der Bearbeitung zu erhöhen und gleichzeitig die Größe der DNA-Deletionen zu minimieren, ein wichtiger Schritt zur Entwicklung von Gen-Editierungstherapien zur Behandlung genetischer Krankheiten.
Die CRISPR-Technologie (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) wird verwendet, um DNA-Sequenzen zu verändern und die Genfunktion zu modifizieren. CRISPR/Cas9 ist ein Enzym, das wie eine Schere verwendet wird, um zwei DNA-Stränge an einer bestimmten Stelle zu schneiden, um DNA-Teile hinzuzufügen, zu entfernen oder zu reparieren. Durch die Modifizierung der Genfunktion hoffen Wissenschaftler, genetische Krankheiten zu behandeln, indem sie die Fähigkeit einer erkrankten Zelle stoppen, die defekte DNA weiter zu replizieren. CRISPR/Cas9 ist die vielseitigste verfügbare genetische Manipulation und hat eine breite Palette potenzieller Anwendungen. Während CRISPR/Cas9 hauptsächlich kurze Insertionen oder Deletionen an der Zielstelle erzeugt, kann es auch große DNA-Deletionen um die spezifische Zielstelle herum machen. Diese großen Löschungen verursachen Sicherheitsbedenken und können die funktionale Bearbeitungseffizienz verringern.
Das WFIRM-Team sucht nach Möglichkeiten, die Wahrscheinlichkeit dafür zu verringern. Die Forschung, die in ihrem jüngsten Artikel beschrieben ist, der kürzlich in veröffentlicht wurde Nukleinsäureforschungversuchten, die Entstehung unvorhersehbarer langer DNA-Deletionen am Zielort anzugehen und einen Weg zu finden, sich dagegen zu schützen, sagte der Hauptautor Baisong Lu, Ph.D., von WFIRM.
„In Anbetracht dessen, dass ein Mangel an Methoden zur Vermeidung der Erzeugung langer Deletionen durch CRISPR/Cas9 eine Herausforderung für das Feld darstellt, entwickeln wir neue Gegenstrategien“, sagte Lu. „Wir haben eine Methode entwickelt, um die Mutationen zu verfeinern – um kleine Deletionen zu erhöhen und große Deletionen zu verringern.“ Das Team bewertete eine Vielzahl von interessierenden menschlichen Zellen und Genen und stellte fest, dass die Fusion von DNA-Polymerase I oder dem Klenow-Fragment mit dem Cas9-Enzym unvorhergesehene große genomische DNA-Deletionen minimierte, ohne die Effizienz der Genombearbeitung zu beeinträchtigen. Im Gegenteil, dies erhöhte sogar die Editiereffizienz in menschlichen Primärzellen.
„Diese Technik erhöhte die Effizienz der Genom-Editierung in Primärzellen und erhöhte nicht die DNA-Substitutionsraten oder Off-Target-Raten“, sagte WFIRM-Direktor Anthony Atala, MD, ein Co-Autor der Veröffentlichung. „Es hat auch große Deletionen verringert und somit die Sicherheit erhöht. Wir können den Prozentsatz erwünschter Mutationstypen erhöhen. Dies verbessert die Effizienz der Störung krankheitsverursachender Gene oder der Wiederherstellung gestörter Gene.“
Zu den Co-Autoren gehören Kyung W. Yoo und Manish Kumar Yadav von WFIRM sowie Qianqian Song vom Department of Cancer Biology der Wake Forest University Health Sciences.
Kyung W. Yoo et al., Das Targeting von DNA-Polymerase auf DNA-Doppelstrangbrüche reduziert die Größe der DNA-Deletion und erhöht die von CRISPR/Cas9 erzeugten Template-Insertionen, Nukleinsäureforschung (2022). DOI: 10.1093/nar/gkac186