In einem Kürzlich durchgeführte Studie veröffentlicht in iScienceForscher haben das Tet-On-System optimiert, um die Effizienz der Erzeugung von Skelettmuskelzellen und anderen differenzierten Zelltypen aus iPSCs für verschiedene grundlegende und klinische Forschungszwecke zu verbessern. Das Team wurde von außerordentlichem Professor Hidetoshi Sakurai (Abteilung für klinische Anwendung) und außerordentlichem Professor Knut Woltjen (Abteilung für Life Science Frontiers) geleitet.
Eine entscheidende Herausforderung für Forscher bei der Herstellung differenzierter Zellen und Gewebe aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) ist die Heterogenität. Beispielsweise führt eine Kontamination durch undifferenzierte oder teilweise differenzierte Zellen zu Reproduzierbarkeits- und Sicherheitsproblemen bei der Krankheitsmodellierung bzw. der Zelltherapie.
Das Tetracyclin-induzierbare Genexpressionssystem (Tet-On) ist ein grundlegendes genetisches Instrument, das von Forschern eingesetzt wird, um die Transgenexpression als Reaktion auf Doxycyclin, ein weit verbreitetes Antibiotikum, zu regulieren. Konkret basiert das System auf der Fähigkeit des Reverse-Tetracyclin-Transaktivators (rtTA), den Tet-On-Promotor, der aus Tet-Operon-Wiederholungen besteht, und den Minimal-Cytomegalievirus-Promotor (CMV) nur in Gegenwart eines Medikaments namens Doxycyclin zu binden aktivieren die exogene Genexpression.
Seine einfache Handhabung ermöglicht es Forschern, die direkte Differenzierung von iPSCs in verschiedene Zelltypen einzuleiten. Die ungleichmäßige Transgenaktivierung bleibt jedoch problematisch, und daher müssen Forscher iPSC-Klone bewerten und auswählen, um diejenigen zu identifizieren, die das interessierende Transgen auf effiziente und stabile Weise exprimieren.
Um das Heterogenitätsproblem anzugehen, kehrten die Forscher zunächst zu den Grundlagen zurück, um die Grundursache für die fehlgeschlagene Transgenaktivierung zu ermitteln. Da die Überexpression von MYOD1 die bevorzugte Induktionsmethode ist, um die myogene Differenzierung von iPSCs voranzutreiben, untersuchten die Forscher zunächst die Fähigkeit eines piggyBac-Transposase-Expressionssystems, MYOD1 (mit mCherry als fluoreszierendes Reporterprotein zur parallelen Anzeige der MYOD1-Expression), rtTA und Neomycin zu überexprimieren (Antibiotika-)Resistenz-positiver Selektionsmarker.
Nach der Einführung des piggyBac-Systems in iPSCs und der Auswahl von Zellen, in deren Genom das System integriert war, wurden die Zellen mit Doxycyclin behandelt, um die myogene Differenzierung zu initiieren. Insbesondere fanden die Forscher heraus, dass nicht alle Zellen MYOD1 exprimierten, was darauf hindeutet, dass viele Zellen das Transgen nicht einschalteten.
Um die Ursache zu ermitteln, trennten sie Zellen mit und ohne mCherry zur weiteren Analyse anhand des von ihnen ausgesendeten Fluoreszenzsignals. Obwohl sie fanden, dass nicht-fluoreszierende Zellen das exogene Gen enthielten, war interessanterweise die rtTA-Expression im Vergleich zu fluoreszierenden Zellen viel geringer.
Basierend auf dieser Beobachtung testeten die Forscher, ob eine Ergänzung der rtTA-Expression die Effizienz der myogenen Differenzierung steigern würde. Wie sie vermutet hatten, steigerte die rtTA-Supplementierung die Differenzierungseffizienz von etwa 40 % auf über 80 %, was darauf hindeutet, dass die rtTA-Expression ein Engpass für die iPSC-Differenzierung sein könnte.
Als nächstes untersuchten die Forscher einen weiteren Faktor, der die Transgenexpression beeinflussen könnte: den positiven Selektionsmarker für Antibiotikaresistenz. Um diesen Parameter zu testen, ersetzten sie das Neomycin-Resistenz-Transgen durch eines, das für Puromycin-Resistenz im piggyBac-System kodiert. Überraschenderweise exprimierten die Zellen, obwohl sie weniger Kopien des Transgens mit Puromycin-Resistenz aufwiesen, nicht nur hohe Mengen an mCherry und rtTA, sondern der relative Anteil der Zellen, die das fluoreszierende Reporterprotein exprimierten, wurde allein durch die Umstellung der Antibiotikaresistenz deutlich erhöht.
Anschließend testeten die Forscher, ob dieser Schalter eine einheitliche MYOD1-Expression und myogene Differenzierung fördern würde. Tatsächlich erreichten sie reproduzierbar eine Differenzierungseffizienz von mehr als 90 %, indem sie stattdessen die Puromycin-Resistenzselektion verwendeten.
Durch die Optimierung der beschriebenen Faktoren und anderer Parameter zeigte das Forschungsteam, dass es iPSCs erfolgreich und mit ausreichender Effizienz in Skelettmuskelzellen differenzieren konnte, sodass eine Klonbewertung und -auswahl nicht erforderlich war. Ausgestattet mit diesem neuen Wissen können Forscher ähnliche Strategien für andere Differenzierungsmethoden anwenden, die zur Erzeugung verschiedener Zelltypen für eine reproduzierbare Krankheitsmodellierung und sichere Zelltherapie erforderlich sind.
Mehr Informationen:
Jun Otomo et al.: Die gleichmäßige Transgenaktivierung in Tet-On-Systemen hängt von der anhaltenden rtTA-Expression ab. iScience (2023). DOI: 10.1016/j.isci.2023.107685