Die DNA-Phosphorothioat (PT)-Modifikation mit einem nicht verbrückenden Sauerstoff im Phosphodiester-Rückgrat, der durch Schwefel ersetzt wird, ist ein epigenetischer Marker in Prokaryoten und ist am bakteriellen Abwehrsystem, am antioxidativen Stress und an der Genregulation beteiligt. Die PT-Modifikation wird spezifisch von Schwefelbindungsdomänen (SBDs) von PT-abhängigen Restriktionsendonukleasen erkannt, was sie zu einem potenziellen Instrument zur Ermöglichung der biotechnologischen Entwicklung macht. Allerdings schränkt der unklare Erkennungssequenzbereich von SBDs die Anwendung ein.
Eine in der Zeitschrift veröffentlichte Studie Wissenschaftsbulletin wurde von Prof. Lixin Zhang (State Key Laboratory of Bioreactor Engineering und School of Biotechnology, East China University of Science and Technology) und Dr. Guang Liu (State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences) geleitet , School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University).
Diese Studie berichtete über eine Technik namens Schwefelbindungsspezifitätssequenzierung (SBS-seq) zur hochauflösenden Charakterisierung des gesamten Sequenzbereichs von SBDs und verwendete Tandem-PT-Modifikationen, um die Bindungsaffinität zu verbessern und den Sequenzbereich von SBDs zu erweitern. Die starke Affinität und das breite Spektrum ermöglichten eine neue Nukleinsäure-Nachweisplattform auf Basis von SBD und PT-DNA.
Um die hochauflösende vollständige Sequenzspezifität von SBDs zu profilieren, haben Yuting Shuai et al. entwickelte die SBS-seq-Technik, die vier Kernschritte umfasst: (1) die Konstruktion einer unvoreingenommenen zufälligen PT-DNA-Bibliothek, wobei die Zufälligkeit der konstruierten PT-DNA-Bibliothek durch Tiefensequenzierung bestätigt wird; (2) In-vitro-Bindungsselektion mit SBD-Protein; (3) Überprüfung des gebundenen Substrats durch Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA); (4) Tiefensequenzierung und Datenanalyse. Die SBS-seq-Ergebnisse wurden durch Fluoreszenzpolarisationstests (FP) und EMSA weiter validiert, und der Mechanismus wurde durch Molekulardynamiksimulationen (MD) erklärt.
Sie fanden außerdem heraus, dass SBDs mit Tandem-PT-Modifikationen eine stärkere Bindungseffizienz an DNA aufweisen, und zeigten, dass das Tandem-PT-Modifikationsdesign den Sequenzbereich weiter erweiterte und die Bindungsaffinität von SBDs verbesserte.
SBS-seq identifizierte die hochauflösende vollständige Sequenzspezifität, und das Tandem-PT-Modifikationsdesign erweiterte den Sequenzbereich weiter und verbesserte die Bindungsaffinität von SBDs. Basierend auf diesen Ergebnissen ermöglichten sie das SBD-basierte Nukleinsäure-Nachweissystem für den Nachweis von ssDNA.
Zusammenfassend entwickelte dieses Team eine hochauflösende, auf Tiefensequenzierung basierende Technik SBS-seq zur Messung der vollständigen Sequenzspezifität von PT-DNA-bindenden SBDs, erweiterte das Sequenzerkennungsspektrum von SBDs und erhöhte die Bindungsaffinität durch Hinzufügen von Tandem PT-Modifikationen in der DNA.
Basierend auf diesen Ergebnissen verbesserten sie die Nachweisempfindlichkeit der auf SBD und PT-DNA basierenden Nukleinsäure-Nachweisplattform. Ihre Arbeit liefert Erkenntnisse für die Forschung zu modifikationsabhängigen Restriktionsendonukleasen und erleichtert biotechnologische Anwendungen der PT-Modifikation.
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Yuting Shuai et al., Profil und Lockerung der Sequenzspezifität von DNA-Schwefelbindungsdomänen erleichtern neue Nukleinsäure-Detektionsplattform, Wissenschaftsbulletin (2023). DOI: 10.1016/j.scib.2023.07.012