Forscher der Northwestern Medicine unter der Leitung von Ruli Gao, Ph.D., Assistenzprofessor für Biochemie und Molekulargenetik, haben ein neuartiges genetisches Sequenzierungstool entwickelt, das die Sequenzierungsanalyse von Genotypen und Phänotypen gleicher Zellen in Tumoren beschleunigt, wie in einer veröffentlichten Studie beschrieben Naturkommunikation.
Die Einzelzell-Nanoporen-RNA-Sequenzierung ist eine neuere Art der genetischen Sequenzierung, die aktuelle Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechniken mit hohem Durchsatz von der Next-Generation-Sequenzierung (NGS), mit der nur kurze RNA-Stränge sequenziert werden können, bis hin zu lang gelesenen dritten RNA-Sequenzierungstechniken vorantreibt. Generationssequenzierung (TGS), mit der die gesamte Länge von RNAs direkt gemessen werden kann.
Es ist jedoch bekannt, dass die fortschrittliche Technik auch hohe Sequenzierungsfehler verursacht und außerdem entweder auf Short-Reads-Sequenzierung – die Generierung übereinstimmender NGS-Daten zur Steuerung der Identifizierung von Mobilfunkdaten – oder auf der Verwendung einer Barcode-Whitelist zur Aufteilung der Daten in echte Zellen und einzelne Zellen basiert Moleküle.
„Diese Technik basiert auf Zell-Barcodes und Einzelmolekül-Barcodes, die wir als eindeutige Molekülidentifikatoren bezeichnen, um einen hohen Durchsatz zu erreichen. Sie sehen also die Herausforderungen aufgrund höherer Sequenzierungsfehler in Barcode-Sequenzen. Derzeit verfügbare Methoden hängen von Daten der nächsten Generation ab oder hängen davon ab.“ eine theoretische Whitelist, um zu erkennen, welche Zell-Barcodes und eindeutigen Molekülidentifikatoren es sind“, sagte Gao, der auch Mitglied des Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center der Northwestern University ist.
Um diesen Prozess zu verbessern, entwickelte Gaos Team scNanoGPS (single-cell Nanopore sequencing Analysis of Genotypes and Phenotypes Simultaneously), ein neues Sequenzierungstool, das eine völlig unabhängige Entfaltung fehleranfälliger Long-Reads in einzelne Zellen und einzelne Moleküle durchführt.
„Um die Anwendung neuartiger Technologien in der Genomforschung weiter zu erleichtern, konstruiert scNanoGPS zusätzliche Funktionsmodule, um sowohl Genotypen (Mutationen) als auch Phänotypen (Gen- und Isoformenxpressionen) in einzelnen Zellen aus Hochdurchsatz-Einzelzell-Nanoporen-RNA-Sequenzierungsdaten zu berechnen“, sagte Cheng-Kai Shiau, Ph.D., Postdoktorand im Gao-Labor und Co-Erstautor der Studie.
scNanoGPS erhöht den Sequenzierungsdurchsatz von Hunderten bis Tausenden von Zellen, was mit den derzeit weit verbreiteten Short-Reads-basierten Einzelzell-RNA-Sequenzierungstechniken vergleichbar ist, und die Expressionsprofile zwischen Short-Read- und Long-Read-Daten sind laut Gao hochgradig übereinstimmend.
„Aufgrund der Abdeckung des gesamten Genkörpers ermöglichen Long-Read-Daten Berechnungen von Spleißisoformen und genetischen Veränderungen, die bei der Short-Read-Einzelzell-RNA-Sequenzierung weitgehend übersehen werden“, sagte Gao.
Um ihr Tool zu validieren, sequenzierte Gaos Team mit scNanoGPS Nierentumorzellen und Lymphozyten und stellte fest, dass die Zellen zelltypspezifische Kombinationen von Isoformen und genetischen Mutationen exprimieren.
„Wir fanden zelltypspezifische Isoformen, darunter sowohl tumorzellspezifische als auch immunzellspezifische Isoformen, und zeigten auch zelltypspezifische Mutationsprofile innerhalb derselben Tumoren“, sagte Lina Lu, Ph.D., Postdoktorandin in der Studie Gao-Labor und Co-Erstautor der Studie.
„Es ist bekannt, dass alternative Spleißisoformen ein entscheidender Mechanismus nach der Transkription sind, um die Proteinkomplexität in menschlichen Zellen zu erhöhen. Wir freuen uns, dass scNanoGPS die direkte Messung von Spleißisoformen auf Einzelzellebene ermöglicht“, sagte Gao.
Für zukünftige Anwendungen hofft Gao, dass scNanoGPS zur Identifizierung zelltypspezifischer Isoformen verwendet werden kann, die zu verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Krebs, Herzversagen und sogar zur Abstoßung von Organtransplantationen beitragen.
„Neuartige Technologien machen die Datengenerierung relativ einfacher, Forscher können neue Datentypen jedoch ohne ein robustes Rechentool nicht effektiv nutzen. scNanoGPS füllt eine Lücke zwischen den Technologien und Anwendungen. Wir hoffen, die leistungsstarke Long-Read-Einzelzellsequenzierungstechnologie verfügbar und zugänglich zu machen.“ an alle allgemeinen Labore“, sagte Gao.
Mehr Informationen:
Cheng-Kai Shiau et al., Hochdurchsatz-Einzelzell-Long-Read-Sequenzierungsanalysen von Genotypen und Phänotypen gleicher Zellen in menschlichen Tumoren, Naturkommunikation (2023). DOI: 10.1038/s41467-023-39813-7