Forscher erfinden Falle zum Einfangen und Vergleichen einzelner Bakterienzellen

Alle Krankenhäuser bekämpfen eine unsichtbare Bedrohung: Pseudomonas aeruginosa. Es handelt sich um eine Bakterienart, die jedes Jahr Tausende von Patienten auf Intensivstationen befällt und dort Sepsis, Lungenentzündung und andere Arten von Infektionen verursachen kann.

„Für den durchschnittlichen gesunden Menschen stellt P. aeruginosa keine ernsthafte Bedrohung dar“, sagte der Bakteriologe Joshua Shrout von der University of Notre Dame. „Aber für diejenigen, die am stärksten gefährdet sind – die immungeschwächt sind, die ein Beatmungsgerät oder einen Katheter verwenden oder die sich von schweren Verbrennungen oder Operationen erholen – ist es nicht nur ernst, sondern lebensbedrohlich. Und das liegt an der hochentwickelten Wirkungsweise der Bakterien.“ Reihe von Selbstverteidigungstaktiken.

Shrout, Professor am Fachbereich Bau- und Umweltingenieurwesen sowie Geowissenschaften, leitet eine Forschungsgruppe, die diese Taktiken bis ins kleinste Detail untersucht. Er erklärt, dass P. aeruginosa nicht nur gegen viele der häufigsten Antibiotika resistent ist, sondern auch leicht an Oberflächen haftet und dort seinen eigenen Schutz schafft, indem es sich mit einem polymerähnlichen Biofilm bedeckt. Unter bestimmten Bedingungen kann P. aeruginosa auch Antibiotikastämme anderer Organismen erwerben und sogar Zyanid erzeugen, um Konkurrenten abzutöten.

Denken außerhalb der Petrischale

Vor einem Jahrzehnt begann Shrout mit Paul Bohn zusammenzuarbeiten, dem Arthur J. Schmitt-Professor für Chemie- und Biomolekulartechnik und Direktor des Berthiaume Institute for Precision Health in Notre Dame. Bohns Labor ist auf die Entwicklung neuer Technologien für eine genauere Analyse von Zellen und Molekülen spezialisiert. Gemeinsam begannen Bohn und Shrout nach neuen Wegen zur Beobachtung von Mikroorganismen wie P. aeruginosa zu suchen und gingen dabei über den traditionellen Prozess der Beobachtung von in einer Petrischale gezüchteten Zellkulturen hinaus.

„Wenn man eine ganze Zellkultur züchtet und beobachtet, sieht man im Durchschnitt allgemeine Verhaltensweisen“, sagte Bohn. „Aber wir wissen jetzt, dass die größten Auswirkungen manchmal von der Minderheit einer bestimmten Bevölkerung ausgehen.“

Shrout erklärte diesen Effekt anhand einer Analogie zum Verhalten anderer Organismen. „Stellen Sie sich vor, Sie sitzen auf Ihrer Veranda und lauschen den Grillen draußen“, sagte er. „Es mag Tausende von Grillen geben, aber diejenigen, die einen betreffen, sind diejenigen, die zirpen. Es kann auch ähnliche Arten von Variationen in Bakterienpopulationen geben. Allerdings verfügen die meisten Mikrobiologen nicht über die Werkzeuge, um die Auswirkungen kleinerer Grillen vollständig einzuschätzen.“ Spieler innerhalb einer Population.“

Bohn und Shrout wussten, dass sie einige große technische Herausforderungen lösen mussten, bevor sie die entscheidenden Unterschiede in einer Population von P. aeruginosa finden konnten. Zunächst müssten sie einzelne Zellen erfassen. Um ein sinnvolles Experiment durchzuführen, müssten sie dann zur gleichen Zeit denselben Reiz auf die gleiche Weise auf die Zellen ausüben. Und schließlich bräuchten sie eine Möglichkeit, das Experiment zu beobachten und die Unterschiede zwischen den Zellen zu verfolgen, wenn sie auf den Reiz reagieren.

Mit Mitteln des National Institute of Allergy and Infectious Diseases und der National Science Foundation beschlossen Bohn und Shrout, einen neuen Ansatz zu entwickeln. „Zu Beginn“, sagte Bohn, „waren wir von einer sehr einfachen Frage fasziniert: ‚Was wäre, wenn wir Löcher mit demselben Durchmesser wie die Bakterienzellen bohren? Wenn wir das tun, könnten wir dann die Zellen dazu bringen, sich hineinzuziehen und darin zu bleiben?‘ “

Eine bessere Bakterienfalle bauen

Allison Cutri, eine Chemie-Doktorandin in Bohns Forschungsgruppe, nahm die Herausforderung an, das Gerät im Rahmen ihrer Dissertationsforschung zu entwickeln. Cutri arbeitete mit dem Postdoktoranden Vignesh Sundaresan zusammen, um die Hauptplattform des Geräts im Reinraum der Nanofabrication Facility von Notre Dame zu entwickeln. Sie nutzten einen additiven Prozess und bauten die Plattform Schicht für Schicht wie einen Mikrochip auf. Für den Kern des Geräts verwendeten sie eine Epoxidschicht und bedeckten beide Seiten mit einer dünnen Goldschicht, um Strom zu bestimmten Punkten auf jedem Bakterium zu leiten, als würden sie an beiden Enden der Zelle eine Elektrode anbringen.

Dann arbeitete Cutri mit der Integrated Imaging Facility von Notre Dame zusammen, um mehr als 100 winzige Löcher, sogenannte Mikroporen, in das Gerät zu fräsen. Jede Mikropore wird mit einem fokussierten Ionenstrahl auf einen Durchmesser von weniger als einem Mikrometer – oder etwa 50-mal kleiner als der Durchmesser eines menschlichen Haares – gebohrt, damit ein Bakterium hineinschlüpfen kann.

Dank der Neigung von P. aeruginosa, an Oberflächen zu haften, konnte Cutri einzelne Zellen auf dem Gerät und in den Mikroporen festhalten, wo sich jede in ihrer eigenen Pore niederließ. Das Team war dann in der Lage, elektrische Ladungen durch die Goldschichten hindurch anzulegen, während es das Experiment mit einem Fluoreszenzmikroskop filmte, das speziell für die Betrachtung einer Klasse von Bakterienmolekülen entwickelt wurde.

Sie beobachteten ein Leuchten aus den Vertiefungen, was bewies, dass das Gerät ordnungsgemäß mit Bakterien beladen war. Und als sie ein Zellenregiment nach dem anderen testeten, stellten sie fest, dass sich Muster abzeichneten. Einige Zellen leuchteten zusammen mit der elektrischen Ladung. Andere leuchteten zeitweise als Reaktion auf die Ladung, während ein dritter Satz unabhängig von der Ladung leuchtete.

„Wir sind uns immer noch nicht sicher, welche weiteren Unterschiede bestehen könnten oder was die Unterschiede für die Bekämpfung von P. aeruginosa bedeuten“, sagte Shrout. Bei weiteren Untersuchungen konnten sie jedoch ähnliche Muster bei einer anderen Bakterienart erkennen: E. coli. Sie konnten auch feststellen, dass der Stoffwechselzustand jeder Zelle – ob sie Energie aufnimmt oder verbraucht – eine Schlüsselrolle bei der Gestaltung ihres Verhaltens spielt.

Vorerst sagten die Forscher, sie seien zuversichtlich, dass die von ihnen beobachteten Muster und das von ihnen erstellte Gerät, die kürzlich in beschrieben wurden Zellberichte Physikalische Wissenschaftwird ähnliche Forschungsprojekte inspirieren.

„Wir wissen seit einiger Zeit, dass P. aeruginosa als Reaktion auf eine Ladung ein fluoreszierendes Verhalten zeigt“, erklärte Cutri. „Aber um zu erkennen, dass es so viele Unterschiede in der Art und Weise gibt, wie Zellen reagieren, braucht man ein Gerät, mit dem man Zellen einzeln beobachten kann. Mit bestehenden Ansätzen würden diese Unterschiede maskiert.“

Shrout fügte hinzu: „Als Forscher ist es lohnenswert, nicht nur neue Fragen zu stellen, sondern auch neue Werkzeuge und neue Plattformen zu entwickeln, die diese Fragen ermöglichen. Indem wir Kenntnisse über das Zellverhalten mit Nanofabrikation und hochauflösender Bildgebung verbinden.“ , das ist es, was wir mit diesem Projekt erreichen konnten.“