Genomgeheimnisse durch Expansionsmikroskopie entschlüsseln

Die Fähigkeit, Gene ein- oder auszuschalten, ist von grundlegender Bedeutung für die Vielfalt, die wir in Zellen, bei Individuen und sogar in Bezug auf Gesundheit und Krankheit sehen. Bei diesem als Gentranskription bezeichneten Prozess werden die in unserer DNA gespeicherten Informationen in eine „Kopie“ namens RNA umgewandelt.

Um diesen Prozess zu verstehen, haben sich Wissenschaftler bis vor Kurzem auf ungenaue Darstellungen und indirekte Experimente verlassen, da er auf molekularer Ebene abläuft und nicht direkt sichtbar ist. Eine bahnbrechende Mikroskopietechnik ermöglicht es Forschern nun jedoch, bisher ungesehene molekulare Prozesse im genetischen Material zu beobachten und wertvolle Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie Gene aktiviert und reguliert werden.

Antonio Giraldez, Ph.D., Fergus F. Wallace Professor für Genetik an der Yale School of Medicine, untersucht DNA-Codes im Genom und wie Zellen diese Codes interpretieren, um einen Embryo zu erzeugen. Ein entscheidender Aspekt beim Verständnis dieser Prozesse ist unsere Fähigkeit, das Genom sichtbar zu machen.

Leider weisen herkömmliche Mikroskopiemethoden Einschränkungen auf. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben Giraldez und seine Kollegen, darunter der Erstautor der Studie, Ph.D. Kandidat Mark Pownall arbeitete mit Joerg Bewersdorf, Ph.D., Harvey und Kate Cushing, Professor für Zellbiologie und Professor für biomedizinische Technik und Physik, zusammen, um eine neue Technik namens Chromatin-Expansionsmikroskopie (ChromExM) zu entwickeln.

In einem online veröffentlichten Artikel in Wissenschaft Sie demonstrieren den Erfolg bei der Vergrößerung des physischen Volumens der Zellkerne von Zebrafisch-Embryonalzellen um das 4.000-fache, um die Bildauflösung drastisch zu verbessern. Die Technik ermöglichte es den Forschern erstmals zu sehen, wie einzelne Moleküle die Genexpression in Zellen während der Embryonalentwicklung beeinflussen, und ein neues Modell für die Regulierung von Genen zu entwickeln.

„Unsere Forschung ermöglicht es uns, grundlegende Prozesse im Zellkern zu erkennen, die die Grundlage für alles im Leben sind, von der Entstehung eines Embryos bis hin zu Krebs“, sagt Giraldez. „Wir können Prozesse sehen, die wir uns vorher nur vorstellen konnten.“

Nachdem Spermien eine Eizelle befruchtet haben, ist das Genom zunächst „still“, sagt Giraldez. Um einen gesunden Embryo zu entwickeln, muss sich die befruchtete Eizelle in eine vorübergehende pluripotente Stammzelle oder eine Zelle, aus der viele verschiedene Zelltypen entstehen können, verwandeln. Um die Fähigkeit dieser Zelle, andere Zellen zu bilden, zu programmieren, muss das Genom in Schwung gebracht werden.

Giraldez und sein Team untersuchen seit Jahren, wie das Genom aktiviert wird. Sie haben bedeutende Fortschritte gemacht, von der Identifizierung wichtiger Akteure bis hin zum Erlernen der aktivierten Gene. „Aber wir hatten noch nie gesehen, wie sich das Genom für uns selbst aktivierte“, sagt Giraldez. „Es gibt einen Unterschied zwischen der Beschreibung, wie Dinge passieren könnten, und dem tatsächlichen Erleben, wie Dinge passieren.“

ChromExM hilft Forschern bei der Visualisierung des Genoms

In seiner früheren Arbeit entwickelte Bewersdorf, der Mitautor der Studie ist, eine Technik namens pan-ExM, bei der Zellen an einem expandierbaren Gel verankert wurden, um die Visualisierung zellulärer Merkmale mit beispielloser Auflösung zu ermöglichen. Als sich das Gel ausdehnte, zog es die Zelle und die darin enthaltenen Proteine ​​auseinander und behielt dabei ihre räumliche Organisation bei, bis die Zelle ein 64-mal größeres Volumen aufwies. Dann wiederholte das Team mit einem zweiten Gel den Vorgang, sodass das Volumen der Zellen um das 4.000-fache wuchs.

Für diese neue Studie haben die Labore von Giraldez und Bewersdorf gemeinsam ChromExM entwickelt und es auf Embryonen angewendet, um zu visualisieren, wie Gene reguliert werden. Nun hatte jede einzelne Zelle etwa die Größe eines Embryos. „Wir verwendeten ein sehr konventionelles Werkzeug, ein konfokales Mikroskop, das uns in Kombination mit ChromExM diese unglaubliche Auflösung der molekularen Maschinerie der Zelle ermöglichte“, sagt Giraldez. „Selbst die leistungsstärksten Mikroskope konnten dies nicht sichtbar machen.“

Der Vorgang, erklärt er, ähnelt den Spielzeugeiern, die sich zu Dinosauriern ausdehnen, wenn man sie ins Wasser legt. Wenn das Ei zum ersten Mal in das Glas fällt, sind die Merkmale des Dinosauriers noch nicht sichtbar. Aber wenn das Spielzeug wächst, verwandelt es sich von etwas Amorphem in eine Kreatur mit detaillierten Merkmalen. „Dieser Dinosaurier ist wahrscheinlich um das Zwei- oder Dreifache gewachsen“, sagt Giraldez. „Stellen Sie sich nun dieses Wachstum im 4.000-fachen Maßstab vor.“

Durch ChromExM konnte das Team erstmals die grundlegenden Prozesse des Genoms in Aktion sehen. Dies ermöglichte es ihnen, ein neues Modell zur Regulierung von Genen zu entwickeln, das sie „Kiss-and-Kick“ nannten, um die Vergänglichkeit der Art und Weise zu beschreiben, wie die regulatorischen Regionen in der DNA, sogenannte Enhancer, mit dem Anfang des Gens (Promotoren) interagieren, um es auszulösen Expression des Gens und wie der Transkriptionsschub dann die regulatorischen Regionen des Gens trennt (oder den Enhancer wegwirft), um die Expression zu unterbrechen.

„Es ist, als würde man von den pixeligen Schwarz-Weiß-Handybildschirmen der Achtziger zu den superhochauflösenden, farbenfrohen Großbildschirmen von heute wechseln“, sagt Giraldez. „Unsere Technik ermöglichte es uns, Details zu sehen, die vorher nicht möglich waren.“

Mit dieser neuen Methode freut sich das Team darauf, Hypothesen zu untersuchen, die bis vor Kurzem nicht überprüfbar waren. Sie wollen beispielsweise nicht nur grundlegende molekulare Prozesse beobachten, sondern auch erforschen, wie verschiedene Gene ein- oder ausgeschaltet werden, wie sie im Verhältnis zu anderen Genen im Zellkern positioniert sind und wie Mutationen die Genpositionen beeinflussen.

Während andere Mikroskopietechniken möglicherweise unerschwinglich teuer sind, ist ChromExM für die meisten Labore zugänglich. „Unsere Arbeit wird eine Methode demokratisieren, um zu sehen, wie molekulare Prozesse im Zellkern ablaufen, was neue Forschungsbereiche eröffnen wird“, sagt Giraldez.

Das Team hofft nun, die Auflösung seiner Technik noch weiter zu verbessern. Während Forscher jetzt in der Lage sind, Moleküle sichtbar zu machen, die mit dem Genom interagieren, können sie immer noch nicht einzelne Gene identifizieren. „Stellen Sie sich vor, Sie sind im Weltraum und machen ein Foto von New York City. Früher konnten Sie nur die Insel sehen, aber jetzt können Sie Menschen in der Stadt sehen“, erklärt Giraldez.

„Aber wir wissen immer noch nicht, wer diese Menschen sind. Wenn Sie sich diese Menschen als die Gene vorstellen, die wir sehen wollen, wollen wir als nächstes eine Kamera, die es uns ermöglicht, uns auf einzelne Menschen zu konzentrieren.“ Dieses Detail wird es Wissenschaftlern ermöglichen, das zu verstehen Grundprinzipien darüber, wie Gene ein- und ausgeschaltet, kaputt oder repariert werden und wie Mutationen ihre Funktion beeinflussen – alles grundlegende Schritte zum Verständnis, wie unsere Gene bei Gesundheit und Krankheit funktionieren.