Eine einzigartige Methode zum Screening großer Bibliotheken nach industriell nützlichen Bakterienstämmen wurde kürzlich von Forschern der Tokyo Tech entwickelt. Der einfache Ansatz kombiniert Biosensoren und Mikrofluidik, um Mutantenstämme, die große Mengen industriell nützlicher Proteine absondern, schnell zu identifizieren und öffnet so die Tür zu weiteren Anwendungen, wie etwa preisgünstigen Biopharmazeutika.
Mit modernen gentechnischen Werkzeugen ist es heute möglich, Mikroorganismen so zu verändern, dass ihre Produktion industriell nützlicher Proteine – wie sie beispielsweise in Biopharmazeutika verwendet werden – gesteigert wird.
Indem wir genetische Veränderungen in diese Organismen einführen, können wir sie als biologische Fabriken nutzen, um große Mengen des gewünschten Proteins zu produzieren. Bakterien mit dieser verbesserten Fähigkeit können Insulin, Wachstumshormone und Enzyme produzieren. Dieser Ansatz zur Steigerung der mikrobiellen sekretorischen Proteinexpression hat zu Durchbrüchen in der Medizin, Industrie und Landwirtschaft geführt.
Dennoch ist die herkömmliche Methode der gentechnischen Veränderung von Bakterienstämmen für eine hohe Proteinproduktion äußerst zeitaufwändig. Dies liegt daran, dass es auf der Einführung genetischer Veränderungen in einzelnen Stämmen und der Bewertung der Wirksamkeit der Proteinproduktion beruht.
Als Alternative verlassen sich Forscher manchmal auf das Screening großer Bibliotheken, um Stämme zu identifizieren, die eine große Menge an Protein absondern. Dies ermöglicht die Extraktion nur der Stämme, die das gewünschte Protein am besten produzieren. Leider basieren aktuelle Screening-Techniken auf mehreren chemischen Behandlungen und sind entweder zu langsam oder zu kompliziert.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat ein Forscherteam nun eine neuartige Hochdurchsatz-Screeningmethode für Mutantenstämme entwickelt. Die Studie wurde von außerordentlichem Professor Tetsuya Kitaguchi vom Tokyo Institute of Technology (Tokyo Tech), Japan, geleitet und in Zusammenarbeit mit Ajinomoto Co., Inc. durchgeführt.
Über die innovative Methode, die Mikrofluidik und vielseitige Biosensorik kombiniert, um schnell verbesserte Bakterienstämme zu identifizieren, die die höchste Menge eines gewünschten Proteins produzieren, wird in ihrer in der Zeitschrift veröffentlichten Studie berichtet Klein.
Zu diesem Zweck verwendeten die Forscher zunächst eine Art Biosensor namens Q-Body, um die Menge des gewünschten Proteins zu messen, die von jedem Stamm produziert wird. Q-Körper sind künstliche Antikörper, die bei der Bindung an ihr Ziel fluoreszierend werden. In diesem Fall sollten sie an das gewünschte Protein binden und so einen Zusammenhang zwischen der Fluoreszenzintensität und der Zielproteinproduktion herstellen.
Darüber hinaus entwickelte das Team ein cleveres Protokoll zur Sortierung der Mutantenstämme anhand ihrer Leistung. Mithilfe der Mikrofluidik-Technologie wurden winzige Wassertröpfchen, die einzelne Bakterien und Q-Körper enthielten, in eine Ölemulsion eingebracht, wobei die gegenseitige Unmischbarkeit von Öl und Wasser ausgenutzt wurde. Diese winzigen Tröpfchen wurden als mikroskopisch kleine Bakterienkulturen und Reaktoren verwendet.
Nach 48-stündiger Inkubation wurden diese mit Öl bedeckten Wassertröpfchen erneut in einer Wasseremulsion eingekapselt und durch ein Durchflusszytometer geschickt. Dieses Gerät verwendet einen Laser und einen Detektor, um die Fluoreszenz jedes einzelnen Tröpfchens zu messen. Anschließend wird ein Sortiermechanismus eingesetzt, um Tröpfchen mit höherer Fluoreszenzintensität zu trennen.
Die Forscher stellten ihre Methode auf die Probe, indem sie eine riesige Bibliothek von Bakterienstämmen durchmusterten, die zur Produktion von FGF9, einem menschlichen Zytokin, erzeugt und Bedingungen ausgesetzt wurden, die zufällige Mutationen verursachen. Mit dieser Methode konnte das Team einen mutierten Stamm identifizieren, der im Vergleich zum Kontrollstamm dreimal so viel FGF9 produzierte.
Dr. Kitaguchi bemerkt: „Der gesamte Screening-Prozess von 106 Mutanten wurde in etwa drei Tagen abgeschlossen und übertraf damit den Durchsatz von Kulturbewertungsmethoden, die die neuesten automatisierten Laborinstrumente verwenden.“
Das Team hat hohe Erwartungen an die Zukunft; Sie hoffen, dass ihre vorgeschlagene Methode aufgrund ihrer Einfachheit, Genauigkeit und Vielseitigkeit einen erheblichen Einfluss auf die Pharmaindustrie haben wird. Dr. Kitaguchi sagt: „Die Anwendung unserer Screening-Methode für die Entwicklung biopharmazeutischer Proteine kann die Zeit, die zur Etablierung hochproduktiver industrieller Mikrobenstämme erforderlich ist, drastisch verkürzen. Wir glauben daher, dass diese Studie zur kostengünstigen Herstellung verschiedener biopharmazeutischer Proteine beitragen kann.“
Mehr Informationen:
Yoshihiro Ito et al, Effiziente mikrofluidische Screening-Methode unter Verwendung eines fluoreszierenden Immunsensors für rekombinante Proteinsekrete, Klein (2023). DOI: 10.1002/small.202207943