Eine groß angelegte genetische Veränderungsmethode enthüllt die Rolle und Eigenschaften duplizierter Gene in Pflanzen

Zum ersten Mal haben Forscher der Universität Tel Aviv eine Technologie im Genommaßstab entwickelt, die es ermöglicht, die Rolle von Genen und Merkmalen in Pflanzen aufzudecken, die zuvor durch funktionelle Redundanz verborgen blieben.

Die Forscher weisen darauf hin, dass der Mensch seit der Agrarrevolution die Pflanzensorten für landwirtschaftliche Zwecke verbessert hat, indem er genetische Vielfalt geschaffen hat. Doch bis zu dieser jüngsten Entwicklung war es nur möglich, die Funktionen einzelner Gene zu untersuchen, die nur 20 % des Genoms ausmachen. Für die verbleibenden 80 % des Genoms, die aus in Familien gruppierten Genen bestehen, gab es im großen Maßstab des gesamten Genoms keine wirksame Möglichkeit, ihre Rolle in der Pflanze zu bestimmen.

Als Ergebnis dieser einzigartigen Entwicklung gelang es dem Forscherteam, Dutzende neuer Funktionen zu isolieren und zu identifizieren, die bisher übersehen wurden. Es wird erwartet, dass die Entwicklung die Art und Weise, wie landwirtschaftliche Nutzpflanzen verbessert werden, revolutionieren wird, da sie auf die meisten Nutzpflanzen und landwirtschaftlichen Merkmale angewendet werden kann, wie z. B. höhere Erträge und Widerstandsfähigkeit gegen Dürre oder Schädlinge.

Die Forschung wurde vom Postdoktoranden Dr. Yangjie Hu unter der Leitung von Prof. Eilon Shani und Prof. Itay Mayrose von der School of Plant Sciences and Food Security der Wise Faculty of Life Sciences der Universität Tel Aviv durchgeführt. An der Studie, die in veröffentlicht wurde, beteiligten sich auch Wissenschaftler aus Frankreich, Dänemark und der Schweiz Naturpflanzen.

Im Rahmen der Forschung nutzte das Forscherteam die innovative Technologie „CRISPR“ zur Genbearbeitung sowie Methoden aus der Bioinformatik und Molekulargenetik, um eine neue Methode zur Lokalisierung von Genen zu entwickeln, die für bestimmte Merkmale in Pflanzen verantwortlich sind.

Prof. Shani sagt: „Seit Tausenden von Jahren, seit der Agrarrevolution, verbessert der Mensch verschiedene Pflanzensorten für die Landwirtschaft, indem er die genetische Variation fördert. Doch bis vor wenigen Jahren war es nicht möglich, gezielt genetisch einzugreifen, sondern nur.“ um wünschenswerte Merkmale zu identifizieren und zu fördern, die zufällig erzeugt wurden. Die Entwicklung von Gen-Editing-Technologien ermöglicht es nun, präzise Veränderungen in einer großen Anzahl von Pflanzen vorzunehmen.“

Die Forscher erklären, dass trotz der Entwicklung genetischer Bearbeitungstechnologien wie CRISPR noch einige Herausforderungen bestehen blieben, die ihre Anwendung auf die Landwirtschaft einschränkten. Eine davon war die Notwendigkeit, so genau wie möglich zu identifizieren, welche Gene im Genom der Pflanze für ein bestimmtes gewünschtes Merkmal verantwortlich sind, das es zu kultivieren gilt. Die akzeptierte Methode zur Bewältigung dieser Herausforderung besteht darin, Mutationen zu erzeugen, also Gene auf unterschiedliche Weise zu verändern und dann Veränderungen in den Merkmalen der Pflanze als Ergebnis der Mutation in der DNA zu untersuchen und daraus etwas über die Funktion des Gens zu lernen .

Wenn sich also beispielsweise eine Pflanze mit süßeren Früchten entwickelt, kann daraus geschlossen werden, dass das veränderte Gen die Süße der Früchte bestimmt. Diese Strategie wird seit Jahrzehnten mit Erfolg angewendet, hat jedoch ein grundlegendes Problem: Eine durchschnittliche Pflanze wie Tomate oder Reis verfügt über etwa 30.000 Gene, und etwa 80 % davon funktionieren nicht einzeln, sondern sind in Familien ähnlicher Gene gruppiert.

Wenn daher ein einzelnes Gen aus einer bestimmten Genfamilie mutiert ist, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass ein anderes Gen aus derselben Familie (tatsächlich eine Kopie, die dem mutierten Gen sehr ähnlich ist) die Phänotypen anstelle des mutierten Gens maskiert. Aufgrund dieses Phänomens, das als genetische Redundanz bezeichnet wird, ist es schwierig, eine Veränderung in der Pflanze selbst herbeizuführen und die Funktion des Gens und seine Verbindung zu einem bestimmten Merkmal zu bestimmen.

Ziel der aktuellen Studie war es, eine Lösung für das Problem der genetischen Redundanz durch den Einsatz einer innovativen Gen-Editing-Methode namens CRISPR zu finden. Prof. Mayrose sagt: „Die CRISPR-Methode basiert auf einem Enzym namens Cas9, das natürlicherweise in Bakterien vorkommt und dessen Aufgabe darin besteht, fremde DNA-Sequenzen zu schneiden. Das Enzym kann also eine sgRNA-Sequenz zuordnen, die die DNA-Sequenz identifiziert, die das Enzym schneiden muss.“ Diese genetische Bearbeitungsmethode ermöglicht es uns, verschiedene sgRNA-Sequenzen zu entwerfen, damit Cas9 fast jedes Gen schneiden kann, das wir ändern möchten. Wir wollten diese Technik anwenden, um die Kontrolle über die Entstehung von Mutationen in Pflanzen zum Zweck der landwirtschaftlichen Verbesserung und insbesondere zu verbessern um die allgemeine Einschränkung zu überwinden, die durch genetische Redundanz entsteht.“

Im ersten Schritt wurde eine bioinformatische Studie am Computer durchgeführt, die im Gegensatz zu den meisten Studien auf diesem Gebiet zunächst das gesamte Genom erfasste. Die Forscher konzentrierten sich auf die Pflanze Arabidopsis, die in vielen Studien als Modell dient und über etwa 30.000 Gene verfügt. Zunächst identifizierten und isolierten sie etwa 8.000 einzelne Gene, die keine Familienmitglieder und daher keine Kopien im Genom haben. Die verbleibenden 22.000 Gene wurden in Familien eingeteilt und für jede Familie wurden geeignete sgRNA-Sequenzen rechnerisch entworfen.

Jede sgRNA-Sequenz wurde entwickelt, um das Cas9-Schneidenzym zu einer spezifischen genetischen Sequenz zu leiten, die die gesamte Familie charakterisiert, mit dem Ziel, bei allen Familienmitgliedern Mutationen zu erzeugen, sodass diese Gene sich nicht mehr überlappen können. Auf diese Weise wurde eine Bibliothek mit insgesamt etwa 59.000 sgRNA-Sequenzen aufgebaut, wobei jede sgRNA für sich genommen in der Lage ist, zwei bis zehn Gene aus jeder Genfamilie gleichzeitig zu modifizieren und so das Phänomen der genetischen Redundanz effektiv zu neutralisieren.

Darüber hinaus wurden die sgRNA-Sequenzen in zehn Unterbibliotheken mit jeweils etwa 6.000 sgRNA-Sequenzen unterteilt, je nach der vermuteten Rolle der Gene – etwa der Kodierung von Enzymen, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren usw. Der Aufbau der Bibliotheken erfolgte nach Angaben der Forscher ermöglichte es ihnen, die Suche nach Genen, die für gewünschte Merkmale verantwortlich sind, zu fokussieren und zu optimieren, eine Suche, die bisher weitgehend zufällig erfolgte.

Im nächsten Schritt wechselten die Forscher vom Computer ins Labor. Hier generierten sie alle 59.000 sgRNA-Sequenzen, die mit der Computermethode entworfen wurden, und verarbeiteten sie in Kombination mit dem Schneidenzym zu neuen Plasmidbibliotheken (dh zirkulären DNA-Segmenten). Anschließend erzeugten die Forscher Tausende neuer Pflanzen, die die Bibliotheken enthielten – wobei jeder Pflanze eine einzelne sgRNA-Sequenz implantiert wurde, die gegen eine bestimmte Genfamilie gerichtet war.

Die Forscher beobachteten die Merkmale, die sich in den Pflanzen nach den Genomveränderungen manifestierten und wann ein interessanter Phänotyp in einer bestimmten Pflanze beobachtet wurde. Anhand der eingefügten sgRNA-Sequenz konnte man leicht erkennen, welche Gene für die Veränderung verantwortlich waren.

Durch die DNA-Sequenzierung der identifizierten Gene war es außerdem möglich, die Art der Mutation, die die Veränderung verursachte, und ihren Beitrag zu den neuen Eigenschaften der Pflanze zu bestimmen. Auf diese Weise wurden viele neue Merkmale kartiert, die bisher aufgrund genetischer Redundanz blockiert waren. Konkret identifizierten die Forscher spezifische Proteine, die einen Mechanismus im Zusammenhang mit dem Transport des Hormons Cytokinin umfassen, das für eine optimale Pflanzenentwicklung unerlässlich ist.

Prof. Shani sagt: „Die neue Methode, die wir entwickelt haben, wird voraussichtlich eine große Hilfe für die Grundlagenforschung zum Verständnis von Prozessen in Pflanzen sein, aber darüber hinaus hat sie enorme Bedeutung für die Landwirtschaft: Sie ermöglicht es, den Pool an Pflanzen effizient und genau aufzudecken.“ Gene, die für Eigenschaften verantwortlich sind, die wir verbessern wollen – etwa die Resistenz gegen Dürre, Schädlinge und Krankheiten oder die Steigerung der Erträge. Wir glauben, dass dies die Zukunft der Landwirtschaft ist: kontrollierte und gezielte Pflanzenverbesserung im großen Maßstab. Heute wenden wir die Methode an Wir haben es mit großem Erfolg auf Reis- und Tomatenpflanzen entwickelt und beabsichtigen, es auch auf andere Nutzpflanzen anzuwenden.“