Die Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) hat das Gebiet der Biologie revolutioniert, indem sie es Forschern ermöglicht, komplexe biologische Prozesse in lebenden Geweben mit hoher Auflösung zu beobachten. Im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopietechniken nutzt TPM niederenergetische Photonen, um fluoreszierende Moleküle zur Beobachtung anzuregen. Dies wiederum ermöglicht ein viel tieferes Eindringen in das Gewebe und sorgt dafür, dass die fluoreszierenden Moleküle oder Fluorophore nicht dauerhaft durch den Anregungslaser geschädigt werden.
Einige biologische Prozesse sind jedoch selbst mit modernsten TPMs einfach zu schnell, um erfasst zu werden. Einer der Designparameter, der die Leistung eines TPM begrenzt, ist die Zeilenabtastfrequenz, gemessen in Bildern pro Sekunde (FPS). Dies bezieht sich auf die Geschwindigkeit, mit der die Zielprobe von dem Anregungslaser entlang einer Richtung überstrichen werden kann (zum Beispiel in einem horizontalen Durchlauf). Eine langsame Abtastfrequenz wirkt sich auch auf die Gesamt-FPS des Systems aus, da sie bestimmt, wie schnell der Laser in die andere Richtung, dh in einem vertikalen Sweep, geschwenkt werden kann. Zusammen schaffen diese einen Kompromiss zwischen der zeitlichen Auflösung des Mikroskops und der Größe des Beobachtungsrahmens.
Um dieses Problem zu umgehen, hat ein internationales Forscherteam aus China und Deutschland kürzlich einen leistungsstarken TPM-Aufbau mit einer beispiellos hohen Zeilenabtastfrequenz entwickelt. Laut ihrem Bericht veröffentlicht in Neurophotonikwurde dieses Mikroskopiesystem für die Abbildung schneller biologischer Prozesse mit hoher zeitlicher sowie räumlicher Auflösung konzipiert.
Einer der Schlüsselfaktoren, die das vorgeschlagene TPM von den herkömmlichen unterscheiden, ist die Verwendung von akusto-optischen Deflektoren (AODs) zur Steuerung des Scannens des Anregungslasers. Ein AOD ist ein besonderer Kristalltyp, dessen Brechungsindex durch Schallwellen präzise gesteuert werden kann. Dies wiederum ermöglicht es uns, einen Laserstrahl wie gewünscht durchzulenken. Noch wichtiger ist, dass AODs eine schnellere Lasersteuerung ermöglichen als die, die mit den in herkömmlichen TPMs verwendeten Galvanometern erhalten wird.
Dementsprechend entwarf das Team ein kundenspezifisches AOD mit einer außergewöhnlich hohen Schallgeschwindigkeit unter Verwendung eines Tellurdioxid (TeO2)-Kristalls, wodurch eine hohe Zeilenabtastfrequenz erreicht wurde. Mit diesem AOD konnte der Laser innerhalb von nur 2,5 Mikrosekunden eine Zeile im Rahmen abtasten, was einer maximalen Zeilenabtastfrequenz von 400 kHz entspricht. In ähnlicher Weise verwendete das Team einen AOD, um eine vernünftig langsame Scanfrequenz in der anderen Richtung zu erreichen.
Um die Anpassbarkeit ihres Mikroskops weiter zu verbessern, fügte das Team die Option hinzu, bei Bedarf auf einen Galvanometer-basierten Laserabtastmechanismus umzuschalten. Dies ermöglichte das Scannen großer Bereiche der Probe mit einer akzeptablen Auflösung und Geschwindigkeit, wodurch es einfacher wurde, kleine interessierende Bereiche zu lokalisieren, bevor zum AOD-Scannen gewechselt wurde.
Das Team führte mehrere Proof-of-Concept-Experimente mit dem neu gestalteten TPM durch. Sie installierten Schädelfenster an gentechnisch veränderten Mäusen und benutzten sie, um die Morphologie und Aktivität von Neuronen sowie die Bewegung einzelner roter Blutkörperchen (RBCs) zu beobachten. Das System erreichte eine Bildrate von bis zu 10.000 FPS mit einer geeigneten AOD-Konfiguration und Bildgröße. Dies reichte aus, um die Geschwindigkeit, mit der sich Kalzium in neuronalen Dendriten ausbreitet, genau zu messen und die Flugbahn einzelner roter Blutkörperchen innerhalb von Blutgefäßen zu visualisieren.
Beeindruckt von diesen Ergebnissen, Dr. Na Ji, Mitherausgeber von Neurophotonik und Luis Alvarez Memorial Chair in Experimental Physics an der UC Berkeley, kommentiert: „Das neue System für die AOD-basierte Rastermikroskopie stellt eine wesentliche Verbesserung der Bildgebungsgeschwindigkeit und -leistung dar, wie in seiner Anwendung für die Kalziumsignalausbreitung und Blutflussmessungen im Gehirn gezeigt wurde in vivo.“
In Zukunft wird das neue Proof-of-Concept-TPM-Design es ermöglichen, schnelle biologische Prozesse zu erfassen, und könnte unser Verständnis von ihnen erheblich verbessern.
Mehr Informationen:
Ruijie Li et al, Zehn-Kilohertz-Zwei-Photonen-Mikroskopie-Bildgebung der dendritischen Einzelzellaktivität und Hämodynamik in vivo, Neurophotonik (2023). DOI: 10.1117/1.NPh.10.2.025006