Fluoreszenzvisualisierung und Bewertung der NPC1L1-vermittelten Cholesterinabsorption auf der Ebene endozytischer Vesikel

Übermäßige Cholesterinabsorption aus dem Darmlumen trägt zur Pathogenese von Hypercholesterinämie bei, die ein gut etablierter Risikofaktor für atherosklerotische kardiovaskuläre Erkrankungen ist. Die Resorption von intestinalem Cholesterin wird hauptsächlich durch das Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1) Protein vermittelt, das für etwa 70 % der Cholesterinresorption verantwortlich ist. NPC1L1-defiziente Mäuse sind resistent gegen ernährungsbedingte Hypercholesterinämie, was eine überzeugende Strategie zur Intervention bei verwandten Krankheiten durch Hemmung der NPC1L1-Expression oder -Aktivität darstellt.

NPC1L1-Protein wird in der Bürstensaummembran des Dünndarms exprimiert. Das Protein ist umfassend N-glykosyliert und besteht aus 1332 Aminosäuren mit 13 Transmembransegmenten, was die Herstellung eines idealen Antikörpers zur Analyse seines Verhaltens in vivo erschwert. Basierend auf den Studien, in denen Zelllinien in vitro verwendet wurden, wird angenommen, dass NPC1L1 die Cholesterinabsorption durch Clathrin-vermittelte Endozytose vermittelt. Dieser Begriff hat jedoch auch einige ungelöste Herausforderungen. Tatsächlich wurden die endozytischen Vesikel von NPC1L1 mit Cholesterin nicht unter physiologischen Bedingungen nachgewiesen, da es kein praktikables Werkzeug gibt, um die Endozytose von NPC1L1-Vesikeln in vivo zu visualisieren und zu bewerten.

Mithilfe der CRISPR/Cas9-Geneditierungstechnologie haben Wissenschaftler der Naval Medical University in China ein Mausmodell erstellt, in dem das endogene NPC1L1-Protein mit dem verstärkten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) markiert wurde. Die NPC1L1-EGFP-Mäuse ermöglichten den Forschern, die vesikuläre Endozytose von NPC1L1-cago während der Cholesterinabsorption im Darm fluoreszierend zu visualisieren und zu bewerten. Diese Studie wurde online veröffentlicht in Lebensstoffwechsel.

In dieser Studie wurde festgestellt, dass die homozygoten NPC1L1-EGFP-Knock-in-Mäuse eine normale Cholesterin-Homöostase unter „Chow“- oder cholesterinreichen Diätbedingungen aufweisen. Die Fluoreszenz des NPC1L1-EGFP-Fusionsproteins lokalisierte eher an der Bürstensaummembran der Zotten als an den Krypten im Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum, aber nicht im Dickdarm. Das Muster stimmt mit den Eigenschaften der endogenen NPC1L1-Verteilung in den Kontrollmäusen überein. Die EGFP-positiven Vesikel wurden bereits innerhalb von 5 Minuten unter der Bürstensaummembran sichtbar gemacht und erreichten ihren Höhepunkt 15 Minuten nach oraler Sondenernährung von Cholesterin.

Bemerkenswerterweise kolokalisierten die Vesikel mit dem frühen endosomalen Marker EEA1 und dem philippinisch gefärbten freien Cholesterin, und die Cholesterinsonde löste die Ansammlung von EEA1-positiven Vesikeln unter der Bürstensaummembran aus. Die Vorbehandlung mit dem NPC1L1-Inhibitor Ezetimib hemmte die Bildung dieser cholesterininduzierten endozytischen Vesikel, was weiter dafür spricht, dass die vesikuläre Endozytose an der NPC1L1-vermittelten Cholesterinabsorption beteiligt ist.

Diese Studie zeigt zum ersten Mal deutlich freies Cholesterin in endozytischen NPC1L1-Vesikeln während der intestinalen Cholesterinabsorption unter physiologischen Bedingungen. Es bietet ein praktikables Werkzeug zur Bewertung der vesikulären Endozytose von NPC1L1-Frachten sowie der Cholesterinabsorption in vivo unter pathophysiologischen und pharmakologischen Bedingungen und kann in der Arzneimittelforschung eingesetzt werden.

Da NPC1L1 außerdem die intestinale Resorption von Nicht-Cholesterinsterolen wie Phytosterolen und Tocopherolen vermittelt, ist dieses Mausmodell auch für Forscher auf dem Gebiet der Sitosterolämie und des Vitamin-E-Mangels von Vorteil.